1、,一、微生物的基本技术 1.制备培养基：计算称量溶化灭菌倒平板。 2.无菌技术：主要指消毒和灭菌。 3.倒平板操作：待培养基冷却至50 左右时，在酒精灯火焰旁倒平板。 4.微生物接种技术：（1）平板划线操作：平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。,（2）稀释涂布平板法：先将菌液进行一系列梯度稀释后涂布平板，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散到培养基的表面，从而在培养基表面形成单个菌落。如图：,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的
2、水珠落入培养基造成污染。,二、微生物的营养、分离与计数 1.微生物的营养,2.某种微生物的分离与计数 （1）分离选择培养基。 （2）计数 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 a.筛选菌株：利用选择培养基筛选菌株。 b.计数方法：活菌计数法和显微镜直接计数法。 c.过程：土壤取样样品的稀释微生物的培养与观察。 分解纤维素的微生物的分离,a.实验原理即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 b.流程：土壤取样选择培养梯度稀释涂布平板挑选菌落。,(3)鉴定方法,平板划线法适用于微生物的纯化，但不能用于微生物的计数。 稀释涂布平板法常用于活菌计数法，而显微镜直接计数法不能区分细菌的死活。用稀释涂布平
3、板法进行计数时，为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。 土壤中纤维素分解菌的筛选流程中的“选择培养”是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定。,三、微生物在传统发酵技术中的应用,果酒、果醋制作过程中防止杂菌污染的措施 榨汁机和发酵瓶等都需清洗干净，且发酵瓶要进行消毒。 清洗葡萄时要先清洗后除枝梗。 发酵瓶排气管用曲颈管，不用直管。,微生物培养的操作要领 【典例1】(2011新课标全国卷)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染，某同学欲从污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题： (1)在筛选的过程中，应将土壤样品稀释液接种于以_为惟一碳源的固体
4、培养基上，从功能上讲，该培养基属于_培养基。 (2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常用的接种方法有两种，即_和_。,(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力_。 (4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、_和_。无菌技术要求实验操作应在酒精灯_附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。,【标准解答】解答本题的关键是：掌握微生物的实验室培养技术，包括培养基的分类、灭菌方法、无菌操作等技术。 (1)实验目的是为了筛选出可以降解原油的高效菌株，因此在筛选的时候选择培养基的惟一碳源为含有碳元素的原油。 (2)纯化分离微生物的方法有两种
5、：平板划线法和稀释涂布平板法。 (3)菌株分解周围的营养物质，出现分解圈，分解圈大说明该菌株的降解能力强。,(4)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌；微生物的培养要求严格的无菌技术，操作时在酒精灯火焰附近进行，避免周围其他细菌的污染。 答案：(1)原油 选择 (2)平板划线法 稀释涂布平板法 (3)强 (4)干热灭菌 高压蒸汽灭菌 火焰,拓展提升 1.微生物培养技术中的消毒和灭菌,2.平板划线操作的注意事项 (1)每次划线之前都需要灼烧接种环灭菌。 （2）灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。 （3）划线时最后一区域不要与第一区域相连。 （4）划线用力
6、大小要适当，防止用力过大将培养基划破。,1.(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。 (2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_(消毒、灭菌)；操作者的双手需要进行清洗和_；空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。,(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。 (4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细
7、菌进行初步的_。 (5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。 (6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散，造成污染。,【解析】(1)大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短等优点，培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。 (2)灭菌是用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，所以对培养基和培养皿要进行灭菌；而消毒是用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分微生物，所以操作者的双手需要进行清洗和消毒；紫外线能使蛋白质变性，还能损伤D
8、NA的结构。 (3)稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，应保证样品稀释的比例合适。,(4)对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定。 (5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。 (6)因为有的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠道出现严重症状，因此使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散，造成污染。,答案：(1)温度 酸碱度 易培养 生活周期
9、短 (2)灭菌 消毒 损伤DNA的结构 (3)比例合适 (4)鉴定(或分类) (5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生 (6)灭菌,2.发酵法生产酒精后的废液(pH=4.3)含有大量有机物，可用于培养、获得白地霉菌体，生产高蛋白饲料。培养、制取白地霉菌体的实验过程示意图如图所示：,请据图分析回答问题： (1)实验过程中培养白地霉的培养基是_。培养基定量分装前，先调节_，分装后用棉塞封瓶口，最后_处理。 (2)图中过程称为_，从甲到丁的培养过程是为了_。白地霉的代谢类型为_。 (3)为确定菌体产量，图中操作之前，应先称量_的质量。过滤后需反复烘干称量，直至_
10、。所得菌体干重等于_。,【解析】本题是对微生物培养技术的考查，从题干描述与示意图可获知培养白地霉的培养基是废液上清液，因每种微生物生长最适pH不同，故定量分装前，应先调节pH；培养基配制完成，必须灭菌处理，以免混有杂菌与白地霉菌形成竞争；从图示看，之前为搁置斜面，冷却至30 左右就可以接种；从甲到丁，锥形瓶容积越来越大，目的是为了扩大培养；白地霉生长需要大量有机物和氧气，其代谢类型为异养需氧型。,答案：(1)废液上清液 pH 灭菌 (2)接种 扩大培养 异养需氧型 (3)滤纸 恒重(质量基本不变) 恒重时的质量与滤纸质量之差(合理答案均可),3.如图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程，据
11、此回答有关问题：(1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明_。,(2)某同学根据需要，配制了纤维素分解菌的培养基如下，整个实验过程严格执行无菌操作。如果将其中的纤维素粉换成_，菌落数_（填“多于”或“少于”）选择培养基上的菌落数，即可说明选择培养基的作用。 (3)接种微生物最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，本实验宜采用_法，原因是_。,【解析】(1)因为纤维素分解菌与耐热菌有不同的生活习性，生活在不同的环境中，故要根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 (2)因为葡萄糖是纤维素水解产生的、能被微生物直接利用的有机小分子，所以如果将培养基配方中
12、的纤维素粉换成葡萄糖，纤维素分解菌及其他细菌会生长繁殖得更快，故菌落数明显多于选择培养基上的菌落数。 (3)因为稀释涂布平板法要将菌液进行一系列的梯度稀释，故该法可根据稀释体积计算每克样品中的细菌数，而平板划线法则不能这样，所以本实验宜采用稀释涂布平板法。,答案：(1)根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找 (2)葡萄糖 多于 (3)稀释涂布平板 平板划线法难以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数,应用生物技术进行食品加工 【典例2】(2010海南高考)葡萄发酵可产生葡萄酒，请利 用相关的知识回答问题：(1)利用葡萄制作葡萄酒的过程中，发挥作用的微生物是_。,(2)该微生物通过无氧呼
13、吸可分解_，产生的终产物是_和_。 (3)甲、乙、丙三位同学将葡萄榨成汁后分别装入相应的发酵瓶中，在温度等适宜的条件下进行发酵，如图所示。发酵过程中，每隔一段时间均需排气一次。据图分析，甲和丙同学的操作有误，其中甲同学的错误是_，导致发酵中出现的主要异常现象是_。 丙同学的错误是_，导致发酵中出现的主要异常现象是_。,上述发酵过程结束后，甲、乙、丙同学实际得到的发酵产品依次是_、_、_。 (4)在上述制作葡萄酒的过程中，假设乙同学的某一步骤操作错误导致发酵瓶瓶塞被冲开，该操作错误是_。,【标准解答】本题通过图示的形式展示了甲、乙、丙三位同学利用发酵技术生产葡萄酒的实验操作，考查识图、析图能力和
14、实验评价能力。酵母菌既能进行有氧呼吸又能进行无氧呼吸，且只有在无氧环境下发酵产生酒精，欲用酵母菌发酵产葡萄酒需要提供无氧的环境，所以对于实验的装置应严格控制为无氧环境。 (1)利用葡萄制作葡萄酒的过程中，发挥作用的微生物是酵母菌； (2)酵母菌能够利用葡萄糖进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳；,(3)甲同学未夹住发酵瓶的充气管，酵母菌呼吸产生的乙醇被氧化成醋酸，所以发酵液从充气管流出，发酵液变酸；丙同学错在瓶中发酵液过多，淹没了排气管在瓶内的管口，这样发酵液会从排气管流出；甲中乙醇被氧化成乙酸，乙和丙中都能产生乙醇，所以甲、乙、丙同学实际得到的发酵产品依次是果醋、果酒、果酒； （4）乙同学由于未及
15、时排气，导致发酵瓶中气压过大而冲开瓶塞。,答案：(1)酵母菌 (2)葡萄糖 酒精 CO2 (3)未夹住发酵瓶的充气管 发酵液从充气管流出，发酵液变酸 瓶中发酵液过多，淹没了排气管在瓶内的管口 发酵液从排气管流出 葡萄醋(或果醋) 葡萄酒(或果酒) 葡萄酒(或果酒) (4)未及时排气,拓展提升 1.腐乳制作注意事项 （1）影响腐乳品质的条件：水、盐、酒、温度、发酵时间等。 水的控制：含水量约70%，用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形。 盐的控制：盐浓度过高，会影响腐乳的口味；浓度过低，豆腐易腐败变质。 酒的控制：酒精含量应控制在12%左右。酒精含量过高，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，杂菌繁殖快
16、，豆腐易腐败。,温度的控制：控制在15 18 ，适合毛霉生长。 时间的控制：6个月左右。 （2）防止杂菌污染 用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。 装瓶时，操作要迅速小心。加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。,2.判断发酵与无氧呼吸的方法 (1)从概念上判断 发酵：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体及各种不同代谢产物的过程。 无氧呼吸：生物在无氧条件下的一种呼吸方式。 (2)从分类上判断 发酵据产物不同可分为：酒精发酵(无氧呼吸)、乳酸发酵(无氧呼吸)和抗生素发酵等； 据对氧的需求不同可分为：厌氧发酵(无氧呼吸)和需
17、氧发酵； 据培养基的物理状态不同可分为：固体发酵和液体发酵。,1.小李尝试制作果酒，他将葡萄汁 放入已灭菌的发酵装置中进行实验， 恰当的做法是（ ） A.加入适量的醋酸菌 B.一直打开阀b通气 C.一直关紧阀a，偶尔打开阀b几秒钟 D.把发酵装置放到4冰箱中进行实验,【解析】选C。在该发酵装置中有发酵底物(葡萄糖)，但没有发酵生物(酵母菌)，故应在装置中放入适量的酵母菌，所以，A项错误。将阀a一直关紧是为了防止氧气进入发酵装置；偶尔打开阀b几秒钟，是为了排出发酵产生的过多二氧化碳，所以，C项正确。如果一直打开阀b通气，则可使氧气进入发酵装置而影响发酵，所以，B项错误。酵母菌发酵需要的温度在18
18、 25 ，4时温度太低，将影响发酵的速率，所以，D项错误。,2.如图是果酒和果醋制作的实验流程和某同学设计的果酒和果醋的发酵装置。根据图示回答下列问题：(1)完成图1中的实验流程。 (2)冲洗的主要目的是_，冲洗应特别注意不能_，以防止菌种的流失。,(3)图2装置中的充气口在_时关闭，在_时连接充气泵，并连续不断地向内_。 (4)排气口在果酒发酵时排出的气体是由_产生的_，在醋酸发酵时排出的是_。 (5)写出与(4)题有关的反应方程式： _ (6)在果酒发酵旺盛时，醋酸菌能否将果汁中的葡萄糖发酵为醋酸？说明原因：_。,(7)在酒精发酵时瓶内温度一般应控制为_。醋酸发酵时温度一般应控制为_。 (
19、8)果酒制作完成后，可以用_来检测酒精的生成，酒精与之反应呈现_色。,【解析】本题主要考查了果酒、果醋制作的基本过程和原理，同时两种微生物的代谢类型、生存环境也有体现。酵母菌是兼性厌氧型微生物，有氧时反应式为C6H12O66O26CO26H2O；缺氧时反应式为C6H12O62C2H5OH2CO2。因此在制作果酒时，应在缺氧的环境中进行。醋酸菌是好氧菌，能够利用葡萄糖在有氧时生成醋酸；在糖源不足时，将乙醇变为醋酸，即C6H12O62O22CH3COOH2CO22H2O，C2H5OHO2CH3COOHH2O。因此在果酒制作过程中出气口排出的是CO2，而在果醋制作过程中因醋酸菌是好氧细菌，需要连续充
20、气，因此排气口排出的既有CO2，又有含氧量较低的空气。酒精与重铬酸钾发生颜色反应呈灰绿色。,答案：(1)醋酸发酵 (2)洗去浮尘 反复冲洗 (3)果酒发酵 醋酸发酵 泵入空气(氧) (4)酵母菌 CO2 (含氧量少的)空气与CO2 (5)C6H12O62C2H5OH2CO2 C6H12O62O22CH3COOH2CO22H2O C2H5OHO2CH3COOHH2O (6)不能。因为果酒发酵时的缺氧环境能抑制醋酸菌生长，且醋酸菌的发酵条件是氧气充足 (7)18 25 30 35 (8)重铬酸钾 灰绿,3.腐乳，又称乳腐或豆腐乳，是我国著名的民族特产发酵食品之一。其滋味鲜美，酱香宜人，制作历史悠久
21、，品种多样，主要有红方腐乳、酱腐乳和白腐乳等，而红曲酱腐乳既具有红方腐乳适宜的天然红曲色泽，又具有酱腐乳特有的浓郁的酱醋香味，深受人们的喜爱，具有广阔的市场前景。某兴趣小组按照以下工艺流程制作红曲酱腐乳，请据图回答：,(1)现代科学研究表明，许多种微生物参与了豆腐的发酵，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种_状真菌。 (2)在腐乳制作的过程中，毛霉等微生物产生的蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成_和_，_将脂肪水解为甘油和脂肪酸。 (3)传统的制作过程中，豆腐块上生长的毛霉来自_。而现代的腐乳生产是在严格的无菌条件下，将优良的毛霉菌种接种在豆腐上，这样可以_。,(4)搓毛是将长满菌丝的白坯用手抚抹，让
22、菌丝裹住坯体，其目的是_。 (5)在逐层加盐腌坯的过程中，随层数的加高而_盐量，接近瓶口要_铺一些。 (6)红曲酱卤是红曲、面酱、黄酒按一定的比例配制而成的，加入黄酒的作用是_。,【解析】(1)豆腐发酵有多种微生物参与，其中毛霉起主要作用，毛霉是一种丝状真菌。 (2)毛霉等微生物产生的蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸。在多种微生物的协同作用下，豆腐转变成腐乳。 (3)传统制作中，豆腐上的毛霉来自空气中的毛霉孢子，现代腐乳生产是在严格的无菌条件下，将优良的毛霉菌种接种在豆腐上，避免了其他菌种的污染，保证产品的质量。,(4)搓毛促进毛霉覆盖整块腐乳，以
23、防止其他微生物的污染导致腐乳烂块。 (5)加盐的作用是析出豆腐中的水分，使豆腐变硬，在后期制作中不会过早酥烂。同时盐能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。 (6)加黄酒可以抑制微生物的生长，同时使腐乳具有独特的香味。,答案：(1)丝 (2)小分子的肽 氨基酸 脂肪酶 (3)空气中的毛霉孢子 避免其他菌种的污染，保证产品的质量 (4)防止腐乳烂块 (5)增加 多 (6)抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味,4.如图是泡菜的制作及测定亚硝酸盐含量的实验流程示意图，请据图回答：,（1）制作泡菜宜选用新鲜的蔬菜或其他原料，原因是_。 （2）制备泡菜的盐水中清水与盐的质量比约为_，盐水需煮沸并
24、冷却后才可使用，原因是_。 盐水在泡菜制作中的作用为：_。 （3）泡菜风味形成的关键在于_的加入。 （4）泡菜的制作方法不当，很容易造成泡菜变质，甚至发霉变味，试分析可能的原因是_。 （5）发酵过程中应定期测定亚硝酸盐的含量，原因是_ _。,【解析】（1）制作泡菜宜选用新鲜的蔬菜或其他原料，因为这些材料中亚硝酸盐含量低。 （2）制备泡菜的盐水中清水与盐的质量比约为41，其中盐水需煮沸并冷却后才可使用，加热煮沸是为了杀死其他杂菌，冷却后使用是为了保证乳酸菌等发酵微生物的正常生命活动，高浓度的盐水有灭菌的功效，使泡菜清洁又卫生；同时在盐水的作用下，可使蔬菜所含的过多水分渗出。 （3）泡菜风味形成的
25、关键在于调味料的加入。,（4）泡菜的制作方法不当，如泡菜坛子密封不严或取食泡菜的器具不洁，造成杂菌污染或泡菜坛中温度过高都容易造成泡菜变质，甚至发霉变味。 （5）发酵过程中微生物的繁殖活动强弱不同，亚硝酸盐的含量亦不同，亚硝酸盐含量的多少会影响微生物的活动，因此应定期测定亚硝酸盐的含量。,答案：（1）亚硝酸盐含量低 （2）41 加热煮沸是为了杀死其他杂菌，冷却后使用是为了保证乳酸菌等发酵微生物的正常生命活动 盐有灭菌的功效，使泡菜既清洁又卫生；同时在盐水的作用下，可使蔬菜所含的过多水分渗出，渗透部分盐味 （3）调味料 （4）泡菜坛子密封不严或取食泡菜的器具不洁，造成杂菌污染，易引起泡菜腐败变质；泡菜坛中温度过高，亦会引起泡菜发霉变味 （5）发酵的不同时期，微生物的繁殖活动强弱不同，亚硝酸盐的含量亦不同,Thank you!,
