1、植物雄性不育基因的研究进展,?7L)植物学通报 20oo,17(1):1100ImBotany植物雄性不育基因的研究进展(;17 够缪颖陈睦传(厦门磊写_分子物学.讯 36100)摘要本文概述了植物雄性榜不育基因的分子标记及其定位,综述了植物细胞质雄性不育中不育系与保持系在叶绿体和线粒体基因组的结构,转录和翻译产物方面的差异以及和雄性不育之间的可能关系,以及恢复系中的恢复基因分子水平的研究现状;讨论了环境条件如光周期和温度对雄性不育的影响在分子水平上的研究现状,指出了植物雄性不育基因研究方面存在的问题和解决的思路.暮键词堕塑堡些至童 t 芝至重量里,竺璺垦至夏至里 鞠,温度StudiesonM
2、olecularMechanismoftgJeSterilityinPlantsMIAOYiCHENMu-Cuan(Er 血删HBogy,m 一,皿惦 n36l005)AbstractThispaperbevdescribesthecurttstalusofstudies0nthemolecular“la 工kerand1o-calimti0nofthegcmalesterilegenes,studiesonthedationshipsltweenmtDNAstructure,transcfi.p60nandtranslationandcytophsmiemalesterility,anddi
3、erelationshipbetweencpDNAstmettme.tnmseriOllandtranslationandcytopla_emalesterility.rItIerelationbetweenmalesterilityandenvironmentalfactorsisdiscussed.Thepmb】T1sandapproachesreingplantmalesterilitystudiesarepointedout.KeywordsPlantmalesterility,Geniemalesterilegenes,Cytoplasmicmalesterilegenes,P-to
4、ped0d.Temperature作物的雄性不育现象早在 19 世纪就被发现.本世纪以来,雄性不育的遗传理论也不断发展,证明雄性不育表现规律分为胞质不育和核不育两种类型,特别是近代兴起的分子生物学理论和技术,把对植物雄性不育遗传机制的研究推进到了一个更深的领域.近十余年来,由于分离和研究细胞器 DNA 技术的改进,特别是限制性内切酶技术,电泳技术,克隆技术以及序列分析技术,分子杂交技术的改进和发展,对于研究和认识植物雄性不育的分子机制起了巨大的推动作用.产生雄性不育的分子机制虽然各不相同,却不外乎遗传和环境两大因子的影响.从植物雄性不育性的遗传背景来看,可分为核不育和细胞质不育.环境因子对不育
5、性的影响主要表现在温度和光照方面.本文针对植物细胞核不育,细胞质不育,环境条件对雄性不育的影响三方面在基因水平上的研究进展作一综述.1 细胞核雄性不育 IGMS)基因对于 GMS 的分子机制的研究国内外报导都较少.直到 1992 年 Bedinger 等才对核不蒜箭斋臻士耍藿蕤甘2 植物学通报 17 卷育基因进行研究.但 GMS 广泛存在,据 Kaul(D88)统计 ,已在 294 种植物和 21 个种属闻杂交组合中发现了 GMS,35 种植物通过理化诱变也获得了 GMS 突变体.GMS 核不育基因和 CMS 依赖胞质的核不育基因是两类不同性质的基因,它们可处于一体中,在不同时期表达,如玉米,
6、矮牵牛,油菜和梨属.一个物种控制育性的基因位点可能很多,但一个核不育材料多为一对基因控制的.已知小麦 4A,4B,5A,5B 和 5D 染色体上存在着有控制育性的基因位点,每个位点的突变或缺失都能引起雄性不育.太各核小麦的显性不育基因位于 4D 染色体短臂上,并且显性核不育基因 Tal 也广泛应用于小麦的育种实践中(刘秉华和杨丽,992).Aarts 等(1993)从拟南芥中通过转座子标签法分离并测得了第一个核不育基因 MS2 的序列结构.MS2 基因 cDNA 序列中有小段和小麦线粒体 DNA是同源的,同源性这一现象可以为线粒体和呼吸对花粉发育的影响以及线粒体基因重排导致CMS 提供一点线索
7、.对 MS2 基因以及其它物种中的同源基因进一步研究能使我们大大提高对花粉发育的认识,可能给用于杂种生产中的雄性不育植株的生产提供方法.目前我们对白菜型油菜的核不育两用系进行 GMS 基因的分子标记,并筛选出 0.72kh的特异基因片段,经测序,对照 C,enBank,与油菜小孢子发育早期的调控基因 BP458%同源,并含有启动子序列(Mia0 和 Cao,D99).表 l 列举了已定位到确定的染色体上的核不育基因.裹 1 桉不育基因在染色体上的分布2 细胞质雄性不育(CMS)基因近年来,对 CMS 基因的研究集中在 (1)不育系与保持系在叶绿体和线粒体基因组的结构,转录和翻译产物方面的差异以
8、及和雄性不育之间的可能关系上;(2)恢复系中的恢复基因分子水平的研究.2.1 叶绿体 DNAfINA)及其产物与 CMS叶绿体是绿色植物细胞所特有的细胞器,和线粒体一样具有自主性,是高等植物核外的另一类遗传系统.有关印 DNA 对 cMs 的影响的研究并不完全,结论也存在较多的分歧.Prlng 等对玉米 4 种细胞质的 cpDNA 的限制性核酸内切酶片段分析发现: 各胞质的cpDNA 之间投有明显的差异(Ilg 等,999).在高粱细胞质雄性不育材料 cpDNA 的限制性内切酶片段分析中也没有发现与正常胞质的差异.Kadowaki 等(99o)用 PstI 和IaI 酶切水稻黎明不育系及其保持
9、系的 cpDNA 的电泳分析未发现不育系与保持系之间存在多1 期缪颢等:植物雄性不育基因的研究进展态性.在细香葱 cpDNA 的 RnP 和 RAPD 分析及其基因翻译产物-蛋白质合成实验的电泳分析均未发现有差异.在烟草中,目前尚不能决定 cpDNA 是否与雄性不育性有关.在一些杂交种中 cpDNA 与 CMS 也没有关系.但李继耕等在菠菜,玉米,小麦,高粱,水稻等多种作物中,利用 DNA 双相电泳技术对叶绿体与雄性不育性的关系进行系统的研究结果表明:不育系的叶绿体基因组与其相应的保持系之问存在明显的差异.李继耕也对叶绿体蛋白质,叶绿体超微结构进行了研究,都发现不育系和保持系之问存在差异.因此
10、他认为高等植物的细胞质雄性不育性同叶绿体 BNA,叶绿体蛋白质以及叶绿体超微结构之间存在某些联系是肯定的;叶绿体BNA 的突变引起它所编码的一系列蛋白质特性的变化,因此雄性不育性受到影响也是可能的(李继耕,1983).在萝不育系 dOlA 中 cpDNA 的特异性序列编码核糖体蛋白小亚基 sl2的 c.末端 7 个氨基酸残基和 s7 的 N 一末端的 93 个氨基酸残基,从而构成 Ipsl2-ips7操纵子的一部分,说明叶绿体核糖体蛋白 s12 和 s7 可能和 CMS 存在某些联系(李继耕,1992).由于发现大麦可育系比细胞质不育系具有较高的胡萝素含量,较低的叶黄素/胡萝素 B比率以及异常
11、的叶绿素 a/b 比率,因此认为叶绿体可能是大麦雄性不育基因的载体.同时对高粱,甘蓝型油菜,白菜型油菜核质互作型雄性不育,榨菜胞质不育 Cl:DNA 限制性核酸内切酶片段的分析也都显示了叶绿体可能是这些植物胞质不育基因的载体(高洁等,1987)周长久等(994)比较萝 h 雄性不育系的 cpDNA 的 RFLP 的图谱有差异.Chen 等(1993)应用原位杂交技术证实:高粱雄性不育系和保持系的 cpDNAHindI 酶切片段确实不同,并且克隆到 rpvc2 这一基因片段 ,通过测序再和其他作物如水稻 ,玉米,烟草,梨等同源序列比较,证实了 rpoc2 是编码 P,NA 聚合酶亚单位的.但他在
12、报告中对于CMS 机理究竟是否同这一基因片段有关没有作出肯定的结论.因此从现有的研究资料来看,确切认为 cpDNA 一定同雄性不育有关的结论并不多.cpDNA 和 mtDNA 之间是否存在一定的相互作用及这种相互作用是否对 CMS有影响等这些问题都有待于研究.越来越多的研究发现:cpDNa 和 mtDNA 之间存在同源性,epDNA和 CMS 之间关系的研究有待于进一步深入 .2.2 线粒体 DNAImtDNA)及其产物与 CMSLevings 和 Piing(1976)首次利用多种限制性核酸内切酶酶切玉米正常胞质 (N)和T 型胞质的 mtDNA,发现两者的酶切图谱有明显的差异 .他们俩的工
13、作是对细胞质雄性不育胞质基因进行分子水平研究的开端.随后对玉米,珍珠米,向日葵,矮牵牛,甜菜及菜豆等作物的 RFLP 图谱作了研究,都表明 tntDNA 表现了很高的多态性程度 (Levings等,1990),而 cpDNA 则没有多态性,蛋白质离体翻译合成实验电泳后结果一样.在细香葱,水稻和玉米的 mtDNA 的 RFlP 和 RAID 分析所得到的结果也一样 (许仁林等,1995;汪志纯等,1997)对 CMS 的各种材料的研究至今为止都认为胞质不育和 mtDNA 的突变有关.这些突变体经常产生能表达的嵌合可读框 off(openreadingframes).异常的线粒体以及和雄性不育有关
14、的序列明显是由于 DNA 的重排,插入,缺失所产生的(Deway 等.1986)CMS-T 细胞质玉米的线粒体基因 r-.,fl3 编码着一条 13kD 的多肽 uIf13.urf13 蛋白质直接或间接地增加了玉米对真菌的敏感性并且影响花粉的发育(Deway 等,1986).对向4 植物学通报 17 眷日葵可育与 CMS 花药 mIDNA 组成与表达的比较研究发现,其 mtDNA 的差异存在于编码Fl 的 ATP 酶 a 一亚基基因(.tpA)的 3 端.序列分析表明,不育花药 mtDNA 的.t0A编码区下游发生了包括倒位与插入的重排.这种重排产生了一个新的开放可读框 orf,这个可读框可与
15、 atpA 共转录,产生一种 15kD 蛋白质.这表明雄性不育性与 arpA 基因重排所产生的新的 off 以及其编码的 15kD 蛋白质存在密切关系 (Laver 等,1991).Johns 等发现菜豆的 CMS 与线粒体上被称为 PVS 的 3kb 特异序列有关.PVS 序列至少存在两个 0分别编码 10.9kD 和 26.7kD 的蛋白质.Johns 对含 PVS 序列的区域作了 DNA 的限制性图谱和DNA 测序.但文章中并未指出 PVS 序列影响 CMS 的机理(John,1992). 在矮牵牛的 miD.NA 中 pcf 序列和其 CMS 紧密相关,花药中 pcf 的转录频率是叶中
16、 45 倍(Young 等,1987).日本学者 Kadowaki 等(1990)比较了 BT 型不育系与其保持系的线粒体COXl,COXII,Cob,atp6 等基因的组织结构,发现 atp6 基因和 Cob 基因的拷贝数不育系与保持系不同,不育系有 2 个 atp6 基因拷贝,保持系只有 1 个拷贝.DNA 序列分析表明.不育系的 2 个 atp6 基因拷贝中,一个是正常的,另一个是嵌合基因,并认为c 与 BT型雄性不育有关.许仁林等应用 AP-PCR 技术从水稻 WA 型雄性不育系的mlDNA 中得到一个特异的扩增片段.630WA,并证明了-630WA 的确与雄性不育系密切关联 .对.6
17、30WA 片段的序列分析发现,该序列中含有一个包含 2o 个氨基酸残基的短酞的编码区域,其功能如何,值得进一步研究;此序列中含有一个长 l0bp 的小反向重复序列5.AcCATATGGT-3.许仁林等认为这反向重复序列可能是水稻 mlDNA 发生分子内或分子间重组的一个热点部位.小重复序列在植物线粒体基因组上广泛存在,在玉米,甘蓝,小麦,向日葵上都发现,其大小最长的达 689bp,最短的为 7bp.这类小重复序列不仅是 mtDNA 分子内重组的热点区,而且这类发生在小反向重复序列间的分子重组一般难以逆转.和 C,MS 有关的植物线粒体的嵌合基因,如玉米的 n13T 基因(Deway,1986)
18、,矮牵牛的基因(Young 等.1987),水稻的 n 基因( 许仁林等,1995)都是由于小反向重复序列的存在所发生的分子重组的结果.对 polCMS 研究认为它可能来源于芥菜型油菜.许多学者的研究均发现 p0J 胞质不育系和可育系的差异表现在线粒体 DNA 的啦基因的调控水平上(LHomrr 等,1993;1997).Si,ch(1991)认为曲基因上游一个类似 tRNA 因子因其加工过程不同,部分造成呻表达的差异.Handa 等(1992)发现不育胞质线粒体 DNA 在嘶基因位点附近发生重组,产生一个新的能编码 105 个氨基酸的 ory224,这段基因在育性恢复过程中转录受抑制,这段序
19、列可能与 p0l 胞质不育有关.mtDNA 片段的丢失也会引起雄性不育.Pla 等(1995)发现: 烟草的两个 CMS 的突变体,由于缺失 mtDNA 的 had7 基因的最后两个外显子,导致 NAD7 多肽的缺失,NAD7 多肽的缺失虽不至于使大多数细胞丧命,却足以导致花粉的败育.与 CMS 有关的mtDNA 片段见表 2.除了对线粒体主 DNA 研究认为 CMS 和 mtDNA 的重排,插入,缺失有关外,研究者还对线粒体的质粒样 DNA 和 CMS 关系进行了研究.在早期玉米等作物线粒体DNA 的分析研究中,发现存在质粒样 DNA.它们在不育系和保持系中表现出特异性分布,似乎与CMS 有
20、关.Yamaguchi 等(1991) 首次发现 BT 型不育系线粒体中,存在大小为1.5kb(B1)和1.2kb(B2)的两种质粒样 DNA,而在相应的保持系中却未发现质粒样 DNA.随后,在其它水稻不育系和保持系中都发现有质粒样 DNA,但在大小或数量上彼此有差异.Pring 等从玉米 s 型胞质 mtDNA 中发现两个低分子量的质粒样 DNA,被定名为 Sl 和 s2.s1和 s2 在结构上是相似的,两者在近 5 端有 1254bp 的同源区域,每个分子的两端均具有208bp 反向重复序列(IR),IR 的存在类似转座因子的作用.Lonsdale 和 Schardl(1983)证实了S,
21、是的 208bp 的 m 区与线粒体主 DNA 的 6.B,区域有较高的同源性,并且在这个区域内,sl,s2 分子与线粒体主 DNA 发生重组,交换从而导致线粒体主 DNA 的分子重排以及线状化的 mtDNA 分子的产生.从 B1 和 B2 在线粒体主 DNA 和核 DNA 中存在同源顺序来看,质粒样 DNA 可能来自线粒体主 DNA,然后自行复制,并以转座子形式再整合到线粒体基因组的不同位点上.此外,不育系中的质粒样 DNA 也可能插人到核基因组中,作为线粒体向细胞核传递信息的一种机制.但另外的研究发现,质粒样 DNA 和线粒体 DNA无同源顺序,而在核 DNA 中却存在,因此认为质粒样 DNA 也可能来自核 DNA.但有许多事实与上述观点不符.其一.Kadowaki 等在水稻 WO440A 中未发现有线粒体质粒样DNA.其次,野败型 V41A,B 中均含有 4 个质粒样 DNA,并无差异.第三,台中 65A 有 B1 和B2,其同质恢复系也含 Bl 和 B2.因此许多研究者认为游离质粒样 DNA 不一定和 CMS有关系.2.3 核质关系与 0核质关系包括两方面:CMS 依赖的育性基因与胞质的关系和核背景基因型与CMS 胞质的关系.CMS 胞质与 CMS 依赖的和核基因互作方式 ,可以通过 CMS 与可育胞
