1、植物水解酶法快速测定环境水样中有机磷及氨基甲酸酯类农药第 4l 卷第 l 期2002 年 1 月厦门大学(自然科学版)JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)Vo1.41No.1Jan.2002文章编号:04380479c2002101007504植物水解酶法快速测定环境水样中有机磷及氨基甲酸酯类农药钟树明,袁东星,李权龙,王咏梅.(1.厦门大学环境科学研究中心,海洋环境科学教育部重点实验室.福建厦门3610052.河北保定师范专科学校化学系,河北保定 071051)摘要:应用植物水解酶抑制技术快速检测木样中有机磷及氨基甲酸酯类农药 ,对反应的温度,p
2、H 和时问进行优化.常用的几种有机磷及氨基甲酸酯类农药的 i 匾 6 定限在 0.00150.33mg?L 范围内.应用本方法对被农药污染的某河段进行了监测.关键词:有机磷农药;氨基甲酸酯类农药;木样;植物水解酶中图分类号:Xt32 文献标识码:A有机磷和氨基基甲酸酯类农药具有杀虫力强降解快等特点,是现在世界上主要使用的杀虫.江河农药污染主要来源于农药工业废水排放和农业污染.应用乙酰胆碱酯酶抑制特性发展起来的酶化学比色分析法,已广泛应用于痕量和微量有机磷及cc植物水解酶2.6 一二氯乙酰靛酚(kmax480rtm.橙色)反应前后溶液的颜色变化很大,容易鉴别.若样品中不含有机磷及氨基甲酸酯类农药
3、,2,6 一二氯乙酰靛酚迅速水解,溶液颜色由橙色迅速变为蓝色;若样品中含有农药时,植物水解酶的活性受抑制,2,6 二氯乙酰靛酚水解速度变慢或根本不水解.本研究优化了反应条件,建立了快速检测水样中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的检测技术,并应用于被农药污染的某河段的监测.收稿日期:2001 一 O413作者简介:钟树明(1976 一).男.硕士研究生氨基甲酸酯类农药残留的检测,但乙酰胆碱酯酶大都来源于动物血液,材料昂贵,且保存困难.近年来发展了用植物水解酶替代乙酰胆碱酯酶的分析方法【.植物水解酶能促使 2,6 一二氯乙酰靛酚水解,反应如下:c“ 一 c 卜 c 卜O靛酚(max=605nm1 实验
4、部分CI蓝色)1.1 仪器和试剂BECKMANDU8B 紫外一可见分光光度计 ,带恒温装置(美国产),XK95 一【型多用振荡器(江苏新康仪器厂),LD4 2 离心机(北京医用离心机厂).2,6 一二氯乙酰靛酚溶液一:取 0.1mol 干燥的2,6 一二氯靛酚钠盐(德国产,上海试剂有限公司进口分装)于锥形瓶中,加入 0.3mol 的乙酸酐,在振荡厘门大学(自然科学版)2002 年器中振荡 2h.在室温下静置 1h 后加入 600g 碎冰块,15h 后过滤.滤出物用水洗后溶于乙醚中,加无水硫酸铺干燥,在水浴上蒸发至约 10mL,然后加入 4 倍俸积的石油醚稀释或加石油醚直到出现结晶为止.过滤,滤
5、液冰冻冷却后得晶体,再用乙醚/石油醚重结晶一次.真空干燥.晶体避光保存.称取所得晶悼 10mg,溶于 10mLl,4-二氧六环(分析纯,上海试剂三厂)中,即得 l_0mg?mL_.的 2,6 二氯乙酰靛酚指示剂,避光保存.磷酸盐缓冲液(0.1tool?L):混合 94.7mL0.1tool?L 磷酸氢二钠溶液和 5.3mL0.1mol?L_.磷酸二氢铺液,得 pH 值为 8.0 的磷酸盐缓冲液.面粉酶溶液53:称取 5g 市售面粉于锥形瓶中,加入 20mL 蒸馏水,在振荡机上振荡 3Orain,以20003000r?min 转速在离心机上离心 l0min.上清液用针筒式过滤器过滤,得面粉酶溶液
6、,取一定量的酶溶液,加定量的缓冲液及 2.6 二氯乙酰靛酚溶液(参见 1.3),在 605rzTll 处读取吸光值.吸光值在 0.680.70,酶符合本实验标准.置于 4冰箱中保存.50 甲胺磷乳油(福建省三农公司),50 辛硫磷乳油(江苏省城市利民化工厂),增效甲基异柳磷乳油(青岛双收农药公司),80 敌敌畏乳油(江苏梅兰公司),氧化乐果乳油( 中国人民解放军第 9715 工厂),17.5 增效水胺硫磷乳油(湖北省仙桃市农药厂),40 乐果乳油( 沈阳新城公司),敌百虫原粉( 南宁化学工业集团),3 呋喃丹粒剂(南宁化学工业集团).1_2 定性分析方法取两支试管,一支加样品溶液 2.7mL,
7、另一支加磷酸盐缓冲溶液 2.7mL,分别加入 0.2mL 植物水解酶溶液,4O下恒温 10rain,分别加入 0.1mL2.6 二氯乙酰靛酚溶液,40下再恒温 10rain,对比两试管中溶液的颜色.若样品管溶液的蓝色较浅或呈现橙色,说明酶活性受到抑制,样品中含有机磷或氨基甲酸酯类农药.1_3 定量分析方法标准工作曲线的绘制:在 lcm 比色皿中依次加入 2.4mL 磷酸盐缓冲液,0.3mL 农药水溶液(浓度分别为 0.010,0,033,0.067,0.10,0.33,0.67,1.0,3.3,6.7,10.0,33.3,100.0mg?L),O.2mL植物水解酶溶液,在 40下恒温 10mi
8、n.读取吸光值,加 0.1mL2,6 一二氯乙酰靛酚溶液,4O%下再恒温 10rain,在 605nm 处读取吸光值 .用 2.7mI 的磷酸盐缓冲液替代农药溶液,在同上的操作下,得空白溶液的吸光值.按下式计算抑制百分率.抑制率()一垒 l.o自式中 A 表示显色前后空白溶液的吸光值变化;A 样 口表示样品的吸光值变化.抑制率与样品中有机磷及氨基甲酸醋类农药浓度的对数成正比,以抑制百分率对样品中农药浓度的对数作图.得标准工作曲线.定量分析方法采用外标法.2 结果和讨论2.1 反应条件的优化酶反应条件苛刻,因为酶的活性受许多因素的影响.在反应物和植物水解酶用量一定的情况下,影响最大的因素是反应温
9、度,溶液 pH 值和反应时间.本研究考察了反应温度,溶液 pH 值和反应时问与酶活性的关系.2.1.1 反应温度取 2.7mLPH8.0 缓冲溶液,加 0.2mL 植物水解酶溶液和 0.1mL2,6 一二氯乙酰靛酚溶液,改变反应温度.按实验方法 1.3 测定吸光值 A.酶活性与605ilm 处的吸光值成正比,吸光值越大,表示酶活性越大.酶活性与反应温度的关系如图 1 所示.从图1 可知.在反应温度 40时,植物水解酶的活性最大.所以本研究采用的反应温度是 40.2.1.2 溶液 pH 值溶液 pH 值对酶的活性影响很大,取 2.4mL 不同 PH 值的缓冲溶液.加 0.2mL 植物水解酶和 0
10、.1mL2,6 二氯乙酰靛酚溶液,在反应温度 40的条件下.按实验方法 1.3 测定抑制率值.图 2 为试液pH 值与抑制率值的关系.从结果可知,在中性偏碱性条件下反应最佳.本研究采用 8.O 为反应 pH 值.2.1.3 反应时间取 2.7mLPH8.0 缓冲液,加 0.2mL 植物水解酶溶液和 O.1mL2,6 一二氯乙酰靛酚溶液,在 40下反应.考察了加入 2,6 一二氯乙酰靛酚后的水解反应时问和试液吸光值之间的关系,见图 3.试液的吸光值与反应时间在 18min 内基本呈线性关系,而一78?厦门大学 (自然科学版 )2002 拄表 2 某河段农药残留舶监铡结果Tab.2Pesticid
11、esfoundinthewatersamplesalongariver+检出;一:未检出 ;上游,下游从农药厂门口界定3 结论应用植物酶抑制技术检测水样中的有机磷及氨基甲酸酯类农药,成本低廉,测定快速,灵敏度较高,尤其适用于快速定性和半定量监测水样中的农药残留,对控制污染,预报突发性污染事件有重要意义和实用价值.参考文献:1张一宾.孙晶 .国内外有机磷农药的概况及对我国有机磷农药发展的看法_J.农药,1999.38(7):13.2BemaheiM.CremisiniC.MaeiniM,eta1.Determina 一345E63tionof(】rganophospborusandCarbami
12、ePesticideswithaCholineandAcetycholineEleetroehemicalBiosensorJ.Ana1.Lett.1991,24(8):1317133l_韩承辉,王乃岩.用植物酯酶片快速测定蔬菜上有机磷农药 EJ.环境保护,1998,12:3133DavidNK.RobertMG,MillerFG.AStudyofthePhysicalandChemicB1PropertiesoftheGstersofIndophenolsI.PreparationJ_Org.Chem.1959.24:1743 一l75O.李治样一翟延路.应用植物酯酶抑制技术测定蔬菜水果中农
13、药残留J_环境科学.1987.7(4):472478.GeorgeGGuilhault.酶法分析 M北京科学出版杜.1977.195-200.RapidDeterminationofOrgan0ph0sphorusandCarbamatePesticidesinWaterSampleswithPlantHydrolasesZHONGShuming,YUANDongxing,LIQuanlong,WANGYongmei(1.Environ.Sei.ResearchCenter,MinistryofEdu.MarineEnviron.Lab.,XiamenUniv.,Xiamen361005,Ch
14、ina;2.Chem.Dept.,BaodingNormalAcademy,Baoding071051,China)Abstract:Atechniqueusingplanthydrolasesfordeterminationof.rgan.ph.sph0rusandcarbamatepesticidesinwaterhasbeendeveloped.Theparameters,includingreactiontemperature,pHandreactiontime,havebeenoptimized.Forsomecommonlyused0fgan.ph0sph0rusandearbamatepesticides,thedetectionlimitrangeisbetween0.00150.33mg?L.Withtheproposedtechnique.asurveyhasbeencarriedOuttOscreenorganophosphorusandcarbamatepesticidesinriver.Keywords:organophosphorus.earbamate;watersamples;planthydrolases
