1、蛋白激酶 C 同工酶在初发糖尿病大鼠肾小球中的细胞定位及表达?388?中国医科大学 JChinMedUniv 第 32 卷第 5 期 2003 年 l0 月蛋白激酶 C 同工酶在初发糖尿病大鼠肾小球中的细胞定位及表达姚丽,王力宁,周华,范秋灵,马健飞,冯江敏(中国医科大学附属第一医院肾内科,辽宁沈阳 110001)【摘要】目的:探讨蛋白激酶 c(PKC)同工酶 Ot,BI,B,8 在正常及初发糖尿病(DM)大鼠肾小球中的细胞定位及表达变化与糖尿病肾病(DN)发生,发展的关系.方法: 腹腔注射链脲菌素(sax)制成 DM 大鼠模型,采用免疫组化 S.P 方法检测 PKC 同工酶的表达.结果:PK
2、Ca 在正常大鼠肾小球系膜细胞,上皮细胞,内皮细胞中均有表达;PKcB.,8 在系膜细胞中表达;PKC8 在系膜细胞及内皮细胞中表达 .初发 DM 状态下,PKcq 在系膜细胞和内皮细胞中表达上升;PKCJ3I,B 在系膜细胞中表达明显下降 ;PKC8 在系膜细胞及内皮 L 细胞中表达升高不显着.结论:PKC 各同工酶在正常大鼠肾小球内的细胞定位不同.高血糖对 PKC 各同工酶在肾小球内的细胞表达有着不同的调控效应.PKC 各同工酶在初发 DM 大鼠肾脏病变中发挥不同作用.【关键词】蛋白激酶 C;同工酶;肾小球;糖尿病肾病【中图分类号】R392.1【文献标识码】A【文章编号 】02584646
3、(2003)05 038802LocalizationandExpressionofIsoformsofProteinKinaseCinGlomernlrCellsofEarlyDiabeticRatsYAOLi,WAN(;Li-ning,ZHOUHua,FANQiu-lin,MAJianfei,FENGJiang-min(Department0fNephrology,TheFirstAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity.Shenyang110001,China)【Abstract】Objective:Ouraimsweretoinvestigat
4、ethecellularlocalizationandalteredexpressionofproteinIdnaseC(isormsd,BI.B 矗,8)ingIomer 山rcellsofnormalanddiabeticratsandtoev8luatetherelationlmtweenthealteredexpressionofproteinkinaseC(PKC)isoformsandthepathogenesisofdiabeticnephropathy(DN).Mefllods:Theanimalsweredividedintocontrolgroupanddiabeticgr
5、ouprandomly.Hyperglycemiawasinducedwithstreptozotocin(STZ.60ms/ks)inthemaleSprague-Dawleyral8(weight150to170g).Diabeteswasconfirmedwhenbloodr,luowasmorethan?13.9mmol/Lfor2d8afterSTZadministration.Age-matchednormalratsreceivedtlJne(3mg/l【g,0.9%)andservedascontro1.TheexpreiomofPKCisoformsinnormalanddi
6、abeticslomchrcellswereassessedbyusingmethodofim-munohistochemistry.Results:Isoformdwasfoundinthe3majorg【0menllarcelltypesinnormalrats.IBoforlxlBIandB1wereshowninmesan#alcellswitllintheglomerulus.Isoform8wasdetecteding【0mertllarm 髑舢 Igicellsandendothelialcells.Inearlydiabeticrats.immunohistochemlstry
7、revealedamarkedincreaseofexpressionofPKCainglomhrnl8acellsandendothelialceils.ExpressiomofPKCBIandBsignificantlydecreasedintheD瑚山 rmesangialcells.TheexpressionofPKCedidnotsi0ychange.Condusion:ThelocalizafionsofPKC 仅.BI.BI,and8inslo-merularcellsofnormalanddiabeticratsaredifferent.Thealteredexpression
8、sofPKCisoformsarenotsimillaringlomeru-larceilsofearlydiabeticrats.TheeffectsofPKCisofonmonthepathogenesisofDNaredifferent.【Keywords】 proteinkinasec;isoforms;diabeticnephropathy糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)患者最主要的死亡原因之一.近年来人们发现,众多血管活性物质和细胞因子在 DN 的发生,发展中发挥重要作用.而蛋白激酶 C(proteinki
9、naseC,PKC)是这些物质的共同信号转导途径和(或) 作用途径.本实验采用免疫组织【收稿日期】2oo203 一 l3【基金项目】辽宁省自然科学基金资助项目(972256)化学方法检测 PKC 同工酶仅,pI,pI,8 在正常及初发糖尿病大鼠肾小球中的细胞定位及表达变化,以探明初发 DM 状态下 PKC 各同工酶表达变化以及与 DN 发生,发展的关系.1 材料与方法1.1 材料雄性 SD 大鼠 3o 只,体重 150170g,由中国医第 5 期姚丽等.蛋白激酶 C 同工酶在初发糖尿病大鼠肾小球中的细胞定位及表达?389?科大学实验动物中心提供.链脲菌素,美国 SIGMA 公司;兔抗鼠 PKC
10、ot,BI,B ,8IgG 多克隆抗体,美国$aIltaCruz 公司;SP 免疫组化试剂盒 ,日本顺天堂大学医学部第二病理惠赠.1.2 方法1.2.1 模型制备:大鼠随机分为对照组及 DM 组,每组 15 只.DM 组腹腔注射链脲菌素 60mg/kg,2d 后血糖13.9mmol/L 者用于试验,对照组注射等量生理盐水.1.2.2 标本采集:所有大鼠均自由饮水,摄食,于DM 发病 2 周时测量体重,用代谢笼收集 24h 尿液.大鼠在戊巴比妥(50mg/kg,ip)麻醉下,腹主动脉末端插入导管,采血后进行原位肾脏灌洗.取下双肾,称重后留取肾皮质标本,羧甲基纤维素包埋,液氮速冻,一 8O保存.1
11、.2.3 实验室检查:24h 尿蛋白定量采用磺柳酸一硫酸钠比浊法进行检测,以牛血清白蛋白为标准蛋白.血糖采用葡萄糖氧化酶法.血,尿肌酐采用苦味酸法,利用日立 7150 型全自动生化分析仪进行检测,并计算内生肌酐清除率.1.2.4S.P 免疫组化检测:一 25(2 冰冻切片,厚度 4,4丙酮固定.3%H202/PBS 孵育 15min,10%山羊血清/PBS 孵育 15rain.一抗 4过夜.生物素标记二抗 37,60min.HRP37oC,20min.DAB 显色,苏木素复染,封片.PBS 代替一抗为阴性对照,以已知阳性片为阳性对照.1.2.5 结果判定:细胞浆和细胞膜有棕色着色的细胞为阳性细
12、胞.采用双盲法在光镜下随机选择 20个肾小片,计数肾小球的阳性细胞数及细胞总数,各 PKC 同工酶在肾小球细胞中的标记值(%)为阳性细胞数/细胞总数 X100.1.2.6 统计学分析:所有数据均以均数 4-标准差表示,利用 t 检验进行组间资料的比较.2 结果2.1 实验室检查结果(表 1)表 l 两组大鼠实验室检查结果(i4-s)Tab.1Experimentalindexesofearlydiabeticrats(i4-s)2.2PKC 同工酶在对照组肾小球中的细胞定位PKCot 在肾小球系膜细胞 ,上皮细胞,内皮细胞中均有表达;PKC13I,B在系膜细胞中表达 ;PKCe在系膜细胞及内皮
13、细胞中表达.2.3PKC 同工酶在 DM 组肾小球中的细胞定位(表 2)表 2 两组大鼠肾小球中 PKC 同工酶表达变化(i4-s,%)Tab.2TheexpressionofproteinkinaseCisoformsinglomm-larcellsofearlydiabeticrats(i4-s,%)3 讨论PKC 是一个具有 12 种同工酶的大家族,各同工酶具有不同的酶学特性,组织表达及细胞定位,在一系列细胞对外来信号反应的调控过程中发挥不同的生理功能.本文结果证实,Pl 各同工酶在 SD 大鼠肾小球内的细胞定位各不相同,提示在对肾小球细胞功能的调节上,PKC 各同工酶可能发挥不同的作用
14、.我们制备的 2 周 DM 大鼠血糖明显升高,体重减轻,尿量增多,已达到 DM 诊断标准.而内生肌酐清除率增高,肾重/体重比值增加,尿蛋白定量无变化,肾脏病变主要表现为肾小球高滤过及肾脏肥大,处于初发 DM 状态.此时,PKC 各同工酶的表达变化也不相同.PKCot 在初发 DM 大鼠肾小球的内皮细胞,系膜细胞中的表达显着高于正常大鼠,在上皮细胞中无明显变化.PKCot 被激活后,引起肾小球内舒血管/缩血管物质比率增加,小动脉阻力下降,血管扩张,引起肾脏的高灌注,高滤过.2】.PKCot还可以激活 MAPK 系统,调节 c.f0s 和 e-jun 表达,引起 TGF.pI 转录增加.增加的 T
15、GF.pI 与血管紧张素,内皮素.1,血栓素以及血小板活化生长因子等协同,在初发 DM 肾脏肥大中扮演重要角色【1j】.本实验还发现,初发 DM 大鼠肾小球中上升的 PKCa表达主要位于内皮细胞,提示高血糖导致的肾小球内皮细胞的通透性升高主要是由 PKCot 介导的.(下转第 416 页)中国医科大学第 32 卷1640 加兔血清作为复水剂,复水时间 20rain,效果较好.角膜内皮细胞的主要功能是调节角膜内的水分,维持角膜的透明性.真空冷冻干燥的角膜复水后肉眼及裂隙灯显微镜下角膜上皮及内皮完整,光滑,透明,无脱落,整个角膜无水肿,透明.显微镜下角膜内皮细胞呈六边形,界限清晰.深低温冷冻可造成
16、角膜的内皮细胞损伤 J,Neronov 等【7 认为损伤主要表现为细胞对机械性或渗透压性损伤的高度敏感.真空冷冻干燥会对角膜的内皮细胞产生更大的损伤,虽然真空冷冻干燥复水后的角膜内皮细胞密度及活性率低于深低温冷冻保存组,更低于正常兔,但是还是达到了较高的水平.真空冷冻干燥比深低温冷冻会对角膜的内皮细胞产生更大的损伤,但是,研究结果表明真空冷冻干燥可以保持角膜内皮细胞的活性.随着真空冷冻干燥机的质量及性能的不断提高,结构的逐步完善,角膜内皮细胞密度及(上接第 389 页)PKC8 在 DM2 周肾小球内皮细胞及系膜细胞中表达呈上升趋势,但无统计学意义.PKC8 在 DN 发病机制中的作用目前尚不
17、十分清楚.有文献报道【4J,PKC8 在改变糖尿病肾小球毛细血管内皮细胞通透性,激活 MAPK 系统方面与 PKCa 具有协同作用.高糖激活 PKC 后其活性可持续 4872h.PKC 活性持续增强需要 PKC 表达的持续增加和(或)它的蛋白稳定性 .本实验研究表明,DM 发病2 周时肾小球内 PKCpI,B表达明显下降,与 PKCa和 PKC8 的变化相反,推测可能与其在细胞内的定位,基因表达对调控信号的反应,合成与降解的平衡关系不同有关.Nishizuka【6 的研究指出,特异性PKCB 抑制剂有利于 DN 的预防及治疗.另有学者提出 PKCB 与高糖激活 PKC 同工酶家族引起的细胞内效
18、应密切相关【7】.PKcB 在 DN 病程进展中的作用有待进一步探讨.初发 DM 大鼠肾脏的主要病理改变为肾小球滤过率增高及肾脏肥大.其 PKC 同工酶的激活,表达变化与肾小球高滤过,肾脏肥大同时出现,提示PKC 同工酶在 DM 早期肾脏病变中发挥着重要的调控作用.而 PKC 各同工酶的细胞表达变化不同也存活率还会提高,从而创立一种长期的角膜保存方法.【参考文献】1王传富,鞠明诚 .石珍荣,等.深低温长期保存角膜穿透性移植的研究J.中华服科杂志,1990.26(1):l720.2郑湖玲.陈家祺 ,刘华.两种角膜内皮细胞活性染色的应用比较J.中国实用服科杂志.1995,13(11):684685
19、.3申尊茂.李子良 ,谢立信.眼科新编M.第 1 版.北京:人民卫生出版社.1991.14.4谢立信.角膜移植学 M.第 l 版.北京:人民卫生出版社 .2000.164.5李广武,郑从义 ,唐兵.低温生物学M.第 1 版.长沙:湖南科学技术出版社,1998.5758.6黄挺,陈家祺 ,郑健良,等.深低温冷存角膜复温后内皮细胞活性的变化J.眼科研究,2000,18(6):515517.7NemnovAJ,MihailovBA.Cryopreservation0frabbitcorneawithpolyethyleneoxide4OO.Ascanningelectronmicroscopestu
20、dyJ.CryoLett,1989,10(2):279281.提示它们在 DN 的发生,发展中发挥不同作用.【参考文献】1KolehW,HeideckerG,KechsG,eta1.ProteinkinaseCalphaacti.vatesRAF?1bydirectphosphorylafionJ.Nature,1993,364(6434):249252.2CravenPA,PattersonMC,DeRubertisFR.Role0fenhancedarachidonateavailabilitythmhphespholipaseA2pathwayinmedi?ationofincrease
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