1、【产品名称】通用名称：人类 KRAS 基因 7 种突变检测试剂盒（荧光 PCR 法）英文名称：Human KRAS Gene 7 Mutations Fluorescence Polymerase ChainReaction (PCR) Diagnostic Kit【包装规格】12 测试/盒【预期用途】KRAS 基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为 1530%，在结直肠癌患者中的突变率为 2050%。导致 KRAS 处于激活状态的突变主要位于第 12 和 13 密码子上。 KRAS 基因突变一般会使肺癌患者对 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂产生耐药
2、，使结 直肠癌患者对抗 EGFR 抗体类药物产生耐药。但是，2010 年 10月的最新研究发现第 13 密码子上的 Gly13Asp（G13D）突变 亦对抗 EGFR 抗体类药物有治疗反应性（参见：De Roock. W. JAMA. 2010;304(16):1812-1820）。因此，KRAS 基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治 疗费用， 节省宝贵的治 疗时间。大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突 变细胞往往与野生型 细胞混杂在一起，因此所提取的 DNA 常带有大量野生型 DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全 满足临床需要
3、。本试剂盒用于检测人类 KRAS 基因的 12 和 13 密码子上 7 种热点体细胞突变（见表 1），试剂盒以 DNA 为检测样本，提供突 变状态的定性评估。辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的大肠癌等癌症患者。 该产品用于组织中提取 DNA 的 KRAS 基因 7 种突变的检测，为临床医生对大肠癌或肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。表 1 人类 KRAS 基因的 12 和 13 密码子上 7 种热点体细胞突变 突变名称 氨基酸变化 碱基变化 Cosmic ID 公司命名 Gly12Asp 甘氨酸到天门冬氨酸 GGTGAT 521 12-2-A Gly12Ala 甘氨酸到丙氨酸 GGT
4、GCT 522 12-2-C Gly12Val 甘氨酸到缬氨酸 GGTGTT 520 12-2-T Gly12Ser 甘氨酸到丝氨酸 GGTAGT 517 12-1-A Gly12Arg 甘氨酸到精氨酸 GGTCGT 518 12-1-C Gly12Cys 甘氨酸到胱氨酸 GGTTGT 516 12-1-T Gly13Asp甘氨酸到天门冬氨酸GGCGAC 53213-2-A【检测原理】本试剂盒基于实时 PCR 平台 结合了特异引物和双环探针两种技术，检测 DNA 样品中含有的突变基因。利用特异引物对 突变靶序列进行高精准 PCR 扩增放大，与此同时，利用双 环探针对扩增产物进行检测，结合特 别
5、的 PCR 反应程序和高特异 Taq 酶的使用，在实时 PCR 平台上实现对样品 DNA 中突变的检测，以达到 对稀有突变检测的高特异性和高灵敏度，即高的选择能力。【主要组成成份】试剂盒采用 8 联 PCR 管设计 ，每一个 8 联 PCR 管检测一个 样品，8 联管的 1-7(或 A-G，或 8联 PCR 管两端各有一个小孔，小孔居侧端为 1 号管，小孔居中端为 8 号管)管内装有相应的KRAS 基因 7 种突变检测和内控试剂，突变由 FAM 信号指示，内控由 HEX（或 VIC）信号指示；8（或 H）号管作为 DNA 提取质量的外控检测管，亦由 FAM 信号指示，内控和外控作 为对试剂、D
6、NA 质量以及操作本身的 质控，选择的检测区域是人类 KRAS 基因相对保守的区段，约 100bp，这样即便 DNA 有降解，外控和内控仍然能够最真实地反检测所用 DNA的质量非常重要。由于肿瘤的复 杂性，所采集的 临床样品应 KRAS 基因有效的 DNA 量。每个 PCR 反应管内均含有 510 pM 特异性引往往会混有正常组织细胞，不同类型样品正常细胞混杂程度不同，而且提取的物、20 pM 双环探针、 12.5 M dNTPs、175 M氯化镁、1 mM硫酸铵、2.5 mMDNA 纯度和质量也因样品类型而改变，尤其是用福尔马林固定的石蜡切片样氯化钾和纯化水等。 （详见表 2 和表 3）品，
7、福尔马林会对 DNA 有交 联和降解作用，因此请按下面推荐样品类型顺序表 2 试剂盒组成收集样品并提取 DNA 用于检测，客 户可根据临床实际样品的情况进行选择。试剂盒规格 12 测试 1. 推荐样品类型顺序：新鲜病变组织 冰冻病理切片石蜡包埋病理组织或切 8 联 PCR 管反应条 12 条 片。Taq 酶（ KRAS） 35 L 2. 推荐使用商 业化的试剂盒来提取人类基因组 DNA。所提 DNA 需用紫外分光 KRAS 阳性质控品250 L光度计测定浓度，其 DNA 的 OD260/OD280 在 1.82.0。提取完的 DNA 建议立表 3 8 联PCR 管反应条的组成即进行检测，否则请
8、于-20 以下保存，保存 时间不要超过 6 个月。 管号 检测试剂 体积 荧光信号 3. 从新鲜病变组织中取样应确定至少含有 30%肿瘤病变组织。1 A 12-2-A 35 L FAM，HEX/VIC 2 B 12-2-C 35 L FAM，HEX/VIC 4. 石蜡包埋病理组织或切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，所取部分尽量在 3 C 12-2-T 35 L FAM，HEX/VIC 蜡块中部。4 或 D 12-1-A 35 L FAM，HEX/VIC 5. 所用石蜡包埋病理 组织或切片样品一般请选择保存尚未超过 3 年的样品。5 E 12-1-C 35 L FAM，HEX/VIC 【检验方法】
9、6 F 12-1-T 35 L FAM，HEX/VIC 建议在每次 PCR 反应中，每份样品和阳性质控品（STD）、阴性对照（NTC，7 G 13-2-A 35 L FAM， HEX/VIC自备纯化水）共同进行分析。8 H外控35 LFAM 1. 取出 KRAS 阳性质控品和 Taq 酶（KRAS），阳性质控品先解冻，再振荡混匀。其它需要自备的试剂和耗材有：阳性质控品和 Taq 酶（KRAS）需快速离心 15 秒待用。1. 石蜡切片样品 DNA 提取试剂推荐选用厦门艾德生物公司的核酸提取试剂 2. 分别向体积均为 45 L 的待测样品 DNA、KRAS 阳性质控品和纯化水（NTC）（型号：FF
10、PE DNA，Cat NO. ADx-FF01）；组织和胸水可使用厦门艾德中加入 2.25 L Taq 酶（KRAS）， 涡旋器上混匀 15秒，然后快速离心 15 秒。 生物公司的组织、胸水样品 DNA 分离试剂盒（Cat NO. ADx-TI01）。（1） 根据样品来源不同，可将其分 为石蜡切片样品和非石蜡切片 样品。2. 无 DNase 和 RNase 移液器滤芯吸嘴。 新鲜病变组织、冰冻病理切片等都属于非石蜡切片样品。 3. 无 DNase 和 RNase 的纯化水。（2） 石蜡切片样品的 DNA 浓度推荐为 1.53 ng/L，即每单个反应管添加【储存条件及有效期】的 DNA 量为 7
11、.515 ng。根据石蜡切片样品保存的年限不同，建议：须避光储藏在-205。有效期为 10 个月。开瓶后使用不影响 产品有效保存不超过 三个月的石蜡切片样品每单个反应管添加的 DNA 浓度期。使用完 毕后于-205 保存。为 1.5 ng/L；保存年限三个月至一年的石蜡切片样品每单个反应管试剂盒在运输过程中，需要泡沫箱加冰袋密封运输，运 输时间不超过一周，添加的 DNA 浓度为 2 ng/L；保存年限一年至三年的石蜡切片样品每运输温度不高于室温。单个反应管添加的 DNA 浓度为 2.53 ng/L；不推荐使用保存超过三【适用仪器】年的石蜡切片样品。Stratagene Mx3000P?/300
12、5P?、ABI7900HT、ABI7500、ABI StepOnePlus、（3） 非石蜡切片样品的 DNA 浓度推荐为 0.41 ng/L，即每单个反应管添ABI7300、LightCycler480、Bio-Rad CFX96。加的 DNA 量为 25 ng。注意：（4） 稀释样品 DNA 时推荐使用 TE（pH8.0）。稀 释方法不推荐跨数量 级 使用 ABI 仪器时探针模式设置，Reporter Dye：FAM、VIC；Quencher 稀释，即每次稀释倍数控制在 10 倍以内；稀释时取样量体积不宜小 Dye：TAMRA；Passive Reference：NONE。于 5L，以免稀释
13、后终浓度与 预算值有偏差。 在 ABI7900 中，本试剂盒仅适用于 ABI7900 普通机型（非 FAST 机型），3. 在 PCR 管冰架上，轻轻揭开 8 联 PCR 管反应条的条盖。如 发现管盖内侧有液反应程序模式为标准模式，反应体积选择 40 L，且需要 PCR 8 联反应条辅助点，开盖前请先离心。器（BIOplastics 公司，Cat：7900RAN）。4. 将混好的 DNA 样品依次取 5 L 靠着 PCR 管上管壁加入 8 联 PCR 反应条中，然 适用于 LightCycler480代仪器，若需在 LightCycler480代仪器上使后小心盖上 8 联 PCR 管反应条管盖
14、。用，则必须进行荧光校正。若 LightCycler480代仪器也出现荧光交叉现象，注意：加好样品的 PCR 反应条应立即上机实验 ；若因特殊原因不能及时上则也需要进行荧光校正，且需要PCR 8 联反应条辅助器（BIOplastics 公司，机反 应，应将 PCR 反应条置于冰水混合物上或4冰箱（温度恒定）保存，Cat：B-79480）。保存时间不宜超过 12 个小时。 在使用 Stratagene Mx3000P?/3005P?仪器时若发现荧光净升信号 5. 离心 8 联 PCR 管反 应条。（dR）较低且本底荧光（R）非常高，应适当降低仪器的增益设置。6. 将 8 联 PCR 管反应条放入
15、 实时 PCR 仪器。 PCR 反应板布局见表 4 中推荐方法。 有关各仪器的具体设置方法可从厦门艾德生物医药科技股份有限公司网站资料下载区获得。 PCR 仪器在使用过程中应至少每年校准一次。【样本要求】1 / 2表 4 PCR 仪 96 孔板建议布局名 称 1 2 ? 10 11 12 12-2-A 样品 1 样品 2 ? 样品 10 STD NTC 12-2-C 样品 1 样品 2 ? 样品 10 STD NTC 12-2-T 样品 1 样品 2 ? 样品 10 STD NTC 12-1-A 样品 1 样品 2 ? 样品 10 STD NTC 12-1-C 样品 1 样品 2 ? 样品 1
16、0 STD NTC 12-1-T 样品 1 样品 2 ? 样品 10 STD NTC 13-2-A 样品 1 样品 2 ? 样品 10 STD NTC 外控 样品 1 样品 2 ? 样品 10 STD NTC 7. 打开仪器窗口，按照下图中说 明的扩增程序图进行设置。 第一阶段：95 5 分钟，1 个循环；第二阶段：95 25 秒，64 20 秒，72 20 秒， 15 个循环； 第三阶段：93 25 秒， 60 35 秒，72 20 秒，31 个循环； 信号收集：第三阶段 60时收集 FAM 和 HEX（或 VIC）信号，执行实 时 PCR，保存文件。8. 实验结 束后，使用 2 层 PE
17、手套包扎好 PCR 反应条（使用 Mx3000P 仪器时应该待热盖冷却后再处理，以免烫伤，同时可避免由于 PCR 管盖较热易开造成污染），并按生物垃圾 处理。如非特殊需要，严禁打开 PCR 管盖，以防造成 污染。1. 阴性 对照(NTC)的 1-7（或 A-G）号管的 FAM 信号应无曲线升起。若 7 管其中任一管 FAM信号升起，则此次实验结果无效，同时建议重做一次。若 1-7（或 A-G）号管的 HEX（或 VIC）信号及 8（或 H）号管的 FAM 信号偶尔升起，此属正常现象，不影响对突变检测结果的判断。2. 阳性质控品 (STD)的 Ct 值一般小于 20，但可能会由于不同仪器的不同阈
18、值设置而发生波动。3. 确定试验是否成功可信：（1）外控对照反应孔的 FAM 信号应该升起。若为石蜡切片样品，则其 Ct 值应在 1521 之间；若 为非石蜡切片样品，其 Ct 值应在 1319 之间。 （2）若能满足1）的要求，则继续进行分析。 （3）如果其 Ct 值小于（1）规定的范围，说明加入的 DNA 过量，应减少 DNA 加入量再进行试验。但突 变信号无升起或者落在阴性区，该试验结果仍然可信。（4）若外控对照分析为阴性或 Ct 值大于 1）规定的范围， 说 明加入的 DNA 含有 PCR 抑制剂或 DNA 加入量过少，需要重新提取 DNA 或增加 DNA 上 样量再进行试验。但突变信
19、号有升起且落在强阳区，该试验结果仍然可信。 （5）待测样品的内控 HEX（或 VIC）信号应升起。若内控对照分析为阴性或部分管分析为阴性， 说明加入的 DNA 含有 PCR 抑制剂或 DNA 加入量不够，需要重新提取 DNA 后再 进行试验。但如果管内 FAM 有信号，可能是由于突变序列的扩增抑制了内控序列的扩增， 结果仍然可信。4. Ct 值 的确定：确 认未选择校正 荧光参照，按管号 顺序依次 选择单一检测【阳性判断值及检验结果的解释】 版本号：P4.2 生效日期：2015.09 货号：ADx-KR01表 5 结 果判定 8 联管编号 突变名称 强阳 弱阳 阴性 突变 Ct 值 突变 Ct
20、 值 Ct Cut-off值 突 变 Ct 值 1 12-2-A Ct 26 26Ct 28 9 Ct28 2 12-2-C Ct 26 26Ct 29 10 Ct 29 3 12-2-T Ct 26 26Ct 28 11 Ct 28 4 12-1-A Ct 26 26Ct 29 10 Ct 29 5 12-1-C Ct 26 26Ct 29 9 Ct 29 6 12-1-T Ct 26 26Ct 28 10 Ct 28 7 13-2-A Ct 26 26Ct 29 9 Ct 29 地点相隔离。不要使用超过有效期的试剂。8. 应该严格区分阳性质控品和反应试剂的使用，防止 污染 试剂，造成假阳性
21、。9. 实验时注意防止外源 DNA 对试剂的污染，注意先加完样品 DNA 后再进行阳性对照的操作。推荐在制备反应试剂和添加 DNA 模板时，使用单独、专用的移液枪和滤芯枪头。 进行反应试剂制备的地点应当与添加模板的反应管进行检测分析。需要同 时选择阳性质控品反应孔、阴性对照孔和样【检验方法的局限性】品反应孔，然后用户可根据实际 情况确定扩增曲线升起的拐点 处，得到 Ct 值。5. 突变结果的确定：首先确定样品各个反应管各自的突变 Ct 值，然后确定该样品的外控 Ct值。由于样品中突变百分含量各不相同，所得到的突 变 Ct 值也各不相同。根据不同的突变Ct 值，把 样品检测结果分为阴性、弱阳及强
22、阳。具体判定见表 5。（1） 当样品突变 Ct 值大于或等于阴性 临界值时， 则该样品 为阴性或低于本试剂盒的检测下限。（2） 当样品突变 Ct 值小于阴性 临界值时， 进行下列判断：a） 当某个反应管的突变 Ct 值小于阳性临界值时，则该样 品为该反应管对应的突变阳性，即强阳。b） 当反应管的突变 Ct 值大于或等于阳性 临界值时， 则计 算该反应管的 Ct值。若反 应管的 Ct值小于相对应的 Ct Cut-off 值，则该样品也为该反应管对应的突变阳性，即弱阳；反之则为 阴性或低于本试剂盒的检测 下限。6. Ct值 的计算：Ct 值=突变 Ct 值-外控 Ct 值。突变 Ct 值 是指样品
23、突变信号（FAM 信号）对应的 Ct 值；外控 Ct 值是指样 品对应的外控信号（FAM 信号）的 Ct 值。一个样品可能同时含有 2 个或多个突变类型。7. 某些强阳性 样品可能会导致个别突变反应管之间出现交叉信号。当样品在 2 个或 2 个以上反应管出现阳性结果（按照表 5 判读）时，先确定突 变反 应管中 Ct 值最小的为真阳性，再计算各反应管的Ct 值（突变 Ct 值-外控 Ct 值），并按照表 6 所列交叉信号阈值来判定其它反应管是否为交叉信号。（1） 若Ct 值小于交叉信号阈值，则认为是真阳性信号，可判为该突变 反应管阳性；（2） 若Ct 值大于或等于交叉阈值，则认为是交叉信号，可
24、判为该突变反应管阴性。表 6 交叉信号阈值表* 交叉 交叉反应管的阈值 真阳性 12-2-A 12-2-C 12-2-T 12-1-A 12-1-C 12-1-T 13-2-A 12-2-A - - - - - - 12-2-C - - - 11.12 10.95 - 12-2-T - - - - 11.98 - 12-1-A - - - 9.7 10.97 - 12-1-C - - - - 5.58 - 12-1-T - - - - 12.09 - 13-2-A - - - - - - 备注：“-” 表示无交叉反应。“*”根据人工合成标准品的实验数据获得1. 本试剂 盒的检测结果仅供临床参考
25、，对患者个性化治疗的选择应结合其症 10. 实验完毕用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器。状、体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。 11. 所有化学药品都具有潜在的危险性。具有 PCR 实验室上岗证的人员才能使2. 强阳，弱阳区分 仅为检测人员提供结果判读方法，其阳性结果区分不能反用本试剂盒。在首次使用本试剂盒前，公司技 术支持人员对操作者进行映 临床意义的变化。培训。操作时，请穿着合适的实验室工作服、并佩戴一次性手套等防护 3. 阴性结果不能完全排除靶基因突变的存在，样本中 肿瘤细胞过少、核酸 过性措施。产品在正确使用过程中不慎溅入眼内应立即用冲眼器或大量
26、清度降解或扩增反应体系中靶基因浓度低于检测限亦可造成阴性结果。 水冲洗眼睛。4. 肿瘤 组织（细胞）可能存在较大异质性，不同部位取样可能会得到不同的 12. 所有检测样本和试剂盒中的阳性质控品应视为具有传染性物质，操作和检测结果。废弃物处理均需符合相关法规要求：卫生部微生物生物医学实验室生 5. 不合理的样本采集、转运及处理、以及不当的试验 操作和实验环境均有可物安全通用准 则和医疗废物管理条例。能导致假阴性或者假阳性结果。13. 临床实验室应严格按照医疗机构临床基因扩增实验室管理办法（卫6. 本试剂盒仅用于人类 KRAS 基因突变的定性检测，不可用于基因分型；仅能办医政发2010194 号或
27、 现行有效版本）等有关分子生物学 实验室、临检测本试剂盒所包括的已知基因型，不能检测其他未知分型。床基因扩增实验室的管理规范执行。 7. 该检测仅限于规定的样本类型及检测系统（包括适用机型、核酸提取试剂、 【标识的解释】检测方法等）。：保持干燥；：向上；：易碎，小心轻放。8. 对于保存年限过久的石蜡组织样品所提取的 DNA 的检测能力不能按照本【参考文献】说明书进行。1. FDA website：http:/www.fda.gov/AboutFDA/CentersOffices/CDER/ucm 172905.htm.2. McGrath JP, Capon DJ, Smith DH, Che
28、n EY, Seeburg PH, Goeddel DV, 1. 试剂盒外观整洁，标记清晰，无漏液。试剂融化后，无混浊，无沉淀。 Levinson AD, 1983. Structure and organization of the human Ki-ras 2. 检测分别含有 7 种突变类 型的 7 份阳性参考品，阳性参考品符合率 100%； proto-oncogene and a related processed pseudogene. Nature 304 (5926): 5016. 3. Livre A, Bachet JB, Le Corre D, et al. 2006. K
29、RAS mutation status is 3. 检测 10 份阴性参考品，阴性参考品符合率 100%。predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 4. 可以耐受 10 ng 野生型人类基因组 DNA，无非特异；可以 检出 10 ng DNA 样(8): 39925.品中含量低至 1%的 KRAS 基因突变。4. James RM, Arends MJ, Plowman SJ, et al. 2003. KRAS Proto-Oncogene exhibits tumor s
30、uppressor activity as its absence promotes tumorigeneis in 5. 对同一份精密度参考品进行 10次重复，均能检出。Murine Teratomas. Mol Cancer Res. 1: 820825.【基本信息】1. 实验前请仔细阅读本说明书。注册人/生产企业名称：厦门艾德生物医 药科技股份有限公司 2. 本试剂盒结果会受到样品本身的来源、样品采集过程、样本质量、样本运 地址：厦门市海沧区鼎山路 39 号 输条件、样本预处理等因素影响，同时也受到 DNA 提取质量、荧光定量 PCR 邮编：361027仪型号、操作环境以及当前分子生物学
31、技 术的局限性等限制，可能导致得电话：4000-650-680 传真：0592-6806839 出假阳性或假阴性的检测结果。使用者须了解检测过程中可能存在的潜在网址： E-mail： 错误、准确性的局限性。生产许可证编号：闽食药监械生产许第 20090237 号3. 实验 前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项。 【医疗器械注册证编号】国食药监械（准）字 2014 第 3401678 号4. 避免在不必要的情况下冻融试剂盒中的试剂。【产品标准编号】YZB/国 5735-20145. 一般 DNA 用量以 10 ng/反 应为宜，但对于提取质量较差，应相应增加 DNA用量。尤其是福尔
32、马林固定的石蜡病理 样品，因 为福尔马林 对 DNA 的交联作用，该类样品中的 DNA 较易片段化和降解， 虽然紫外分光光度计测量的浓度 DNA 较高，但实际加入反应中的有效 DNA 量并不足够。6. 检测所用 DNA 的质量非常重要， DNA 提取后应进行质控确定提取质量，并应尽快进行试验，如不能马上进行试验，所提 DNA 应立即保存在-20 以下。7. 本试剂盒所有试剂均经过特别配制，以用于上述检测。随意替换试剂盒中的任何试剂，都可能影响使用效果。不同批号试剂盒成分不可相互混用。2 / 2【产品性能指标】 【注意事项】三亿文库 包含各类专业文献、外语学习资料、幼儿教育、小学教育、行业资料、专业论文、中学教育、生活休闲娱乐、 30 人类 KRAS7 种突变检测试剂盒(荧光 PCR 法)说明书-P4.2-12T-2015.10.09 等内容。
