1、捕食线虫性真菌的分离培养及分布规律344 中国兽医 2003 年 7 月第 23 卷第 4 期 ChinJVetSciJuly2003Vo1.23No.4捕食线虫性真菌的分离培养及分布规律杨晓野,杨莲茹,刘珍莲,董世娟,考桂兰(内蒙古农业大学动物科学与医学学院,内蒙古呼和浩特 010018)摘要:对自然界中的捕食线虫性真茵进行了分离和种属区分 ,并对分布规律进行了研究.从土壤,粪便等材料中获得了2 类活性较强的捕食线虫性茵株:即套捕型(hooping)捕食线虫性真茵和粘捕型(sticking)捕食线虫性真茵.主要的代表种类有 3 种.这些捕食线虫性真茵在捕食性结构分生孢子形态及某些生物学特性上
2、有一定差异.套捕型捕食线虫性真茵代表种为少孢节丛孢茵(Arthrobotrysoligospora)和梨形指环茵(Dactylariapyriformis),它们以茵环,茵网作为捕食性结构(器官), 以套捕方式杀灭线虫幼虫.梨形指环茵可产生多量厚垣孢子(chlamydospore).粘捕型捕食线虫性真茵代表种为纺锤隔指孢茵(Dactylellaellipsospora).可形成茵结捕食线虫性结构,以粘捕的方式杀灭线虫幼虫.结果表明:捕食线虫性真茵在土壤和家畜粪便中的分离率是 4O.41;此类茵适合于生存在阴暗,潮湿,富舍腐植质的环境中.在温暖季节时,采用 0.4g/L 玉米粉琼脂培养基(CMA
3、)易于对其进行分离培养.关键词:生物防治;捕食线虫性真茵;分离培养;分布;种类中圈分类号:$476 文献标识码:A 文章编号:10054545(2003)04034403迄今为止,已发现杀线虫性真菌(nematodedestroyingfungi)约 200 多种.从其对线虫的作用方式来看 ,可分为 3 种类型:第 1 种类型是捕食线虫性真菌(nematodetrappingfungus),它们产生捕食线虫性结构(器官),如粘性菌环(收缩或不收缩),粘性菌丝,粘性菌网,粘性菌结等,将线虫幼虫捕获杀死1;第 2 种类型是内寄生性真菌(endoparasitiefungi),它们借助于分生孢子来感
4、染线虫,在线虫体内生长形成菌体,消化吸收掉线虫;第 3 种类型是包囊体和根瘤线虫寄生性真菌(fungalparasitesofcystandrootknotnematodes),它们主要是利用营养菌丝来进攻线虫虫卵或雌虫.捕食线虫性真菌在自然界中分布最广泛,加上其特有的捕食线虫性结构特征明显,而且较其他 2 种类型易于在培养基上进行观察,分离,培养.因此,在杀线虫性真菌防治研究上受到普遍重视2.分离选择捕食线虫性真菌菌株,了解捕食线虫性真菌的生存环境及所需条件,调查这种宝贵的生物资源状况并掌握其分布规律是研究捕食线虫性真菌生物防治线虫病的基础和前提条件 Es7.这方面的工作,国内相关报道不多8
5、.本试验从自然界的土壤,家畜粪便中分离培养捕食线虫性真菌菌株,同时对其生存条件,环境和分布情况进行调查研究,分析其有关生物学规律,为捕食线虫性真菌的研究工作奠定必要的基础条件.1 材料与方法1.1 主要设备与药品隔水式恒温培养箱;OLUMPUS 倒置显微镜;玻璃培养皿(直径 9Oram);琼脂粉(北京化学试剂公司进 121 分装,批号:970406);新鲜玉米粉(经 100 目网筛过滤);葡萄糖,麦芽糖和蛋白胨(均为化学纯,上海试剂二厂生产)等.1.2 幼虫培养及分离真菌材料分离真菌所用材料来源于不同地区,包括 2 个城市 6 个地方的田问,花园,树林中不同土质的土壤以及不同家畜的粪便.其中
6、1O 份来自内蒙古农业大学西区校园;10 份来自内蒙古农业大学东区校园 ;l2 份来收稿日期:20020530基金项目:国家自然科学基金资助项目(39760060)作者简介:杨晓野(1956 一),男,教授,博士.自内蒙古林业科学院植物园;12 份来自内蒙古师范大学校园;10 份来自呼和浩特市东瓦窑集贸菜市场附近;16 份来自包头市土右旗内蒙古农业大学职业技术学院田间,校园,果园;16 份家畜粪便来自内蒙古农业大学牧场的牛,马 ,驴,羊家畜,各为 4 份.1.3 分离捕食线虫性真菌培养基1.3.10.4g/L 玉米粉琼脂培养基(cMA)称取 40g 新鲜玉米粉,加入 1000mL 蒸馏水,微火
7、煮沸 1h,补足水分至1000mL,用纱布过滤,取滤液 1OmL,加蒸馏水 990mL,调pH 值 6.O6.2,再加琼脂粉 2Og,经 15 磅 20min 高压灭菌后,倾注灭菌玻璃培养皿备用.1.3.20.4g/L 玉米粉琼脂双抗培养基(DACMA)制备方法同 0.4g/L 玉米粉琼脂培养基,经 15 磅 2Orain 高压灭菌后,冷却至 5O60;按每毫升玉米粉琼脂培养基中各加入青霉素,链霉素 1000 单位,混匀后,再倾注于灭菌的玻璃培养皿中备用.1.3.30.4g/L 玉米粉液体培养基(LCMA)制备方法同1.3.1,但不加琼脂粉.1.4 线虫第 3 期幼虫的培养,分离与纯化采集新鲜
8、马粪900g,加入约 1/3 锯末和适量水,置于搪瓷盘内,25.C 温箱中培养 1O15d,采用贝尔曼氏法分离第 3 期幼虫.幼虫的纯化与保存根据文献11 所述方法进行.1.5 捕食线虫性真菌的分离和纯化将采自不同地区,6 个地方的土壤 7O 份及 4 种不同动物的粪便 16 份(共 86 份),分别以“ 十 “字形洒在直径为 9cm 的 0.4g/L 玉米粉琼脂双抗培养基上,每份土壤或粪便接种 1 个培养皿.将培养皿置搪瓷盘内,保持一定的湿度,在(20 士 1).C 温箱内培养 37d 后,真菌菌丝可长至培养皿的 z/3 以上.这时,分别于培养皿内加入有活力的线虫第 3 期幼虫 200040
9、00 条,放于温箱内继续培养,每天用倒置显微镜观察 1 次.从出现菌环,菌网或菌结等捕食线虫性结构(器官),同时有幼虫被捕获的培养皿中,镜下切取 5mm5mm 含有捕食线虫性结构的培养物转接种于 0.4g/L 玉米粉琼脂培养基中,继续培养,待菌丝生长布满平皿后,再加入 20004000 条幼虫,每日观察 1 次,再进行转接种.如此反复多次进行分离纯化,即可获得捕食线虫性真菌纯培养物.可将捕食线虫性真菌纯培养物放于 0.4g/L玉米粉琼脂液体培养基中,观察菌株生长情况.i_一一 tj 矗中国兽医 2003 年 7 月第 23 卷第 4 期 ChinJVetSciJuly2003Vo1.23No.
10、43451.6 捕食线虫性真菌的形态学观察与种类区分在倒置显微镜和光学显微镜下对培养基上的捕食线虫性真菌菌丝,孢子及捕食性结构进行详细的观察,并进行拍照.必要时,切下所需部位,放于载玻片上,融化压薄后,再进行详细的高倍镜观察与照相.根据捕食线虫性真菌菌丝,孢子形态及出现的捕食线虫性结构菌环,菌网,菌结的特征性构造,参照文献12及其他有关文献进行鉴定,区分其种属.1.7 捕食线虫性真菌分布规律研究根据不同土质将土壤采样分为 3 组,第 1 组为较湿润土壤,第 2 组为较干燥的一般土壤,第 3 组为较干燥的沙土样土壤;而将家畜粪便设为第 4组.采集土样季节为 4 月中旬,第 1 组土壤是刚下过小雨
11、之后,采集的是树下除去草皮之外含腐植质较多的湿润土壤;而第 2 组和第 3 组是气候较干燥时,采集的除去干燥浮土以外的土壤.第 4 组家畜粪便包括牛粪,马粪,驴粪,羊粪,均为家畜排在外界环境中的粪便.家畜粪便又按照马属动物和反刍动物分为 2 个组.对所采土壤,粪便进行捕食线虫性真菌分出百分率的统计,比较其自然条件,环境因素的异同,对分布情况及相关生物学规律进行研究总结.2 结果2.1 菌株的分离和纯化在 86 个培养皿中,有 39 个在培养2 周后,出现了捕食线虫性结构,同时有幼虫被捕获.经过多次分离,培养,纯化,获得了纯培养物,其他培养皿培养观察至第 6 周仍未发现捕食线虫性结构及幼虫被捕获
12、的现象.2.2 形态学观察及种区分对 39 个出现捕食线虫性结构的培养皿中的菌株纯化后,进行形态学观察及有关特性比较,最终确定分离到 2 类活性较强的捕食线虫性菌株:即套捕型捕食线虫性真菌和粘捕型捕食线虫性真菌.这些捕食线虫性真菌在分生孢子形态,捕食性结构及某些生物学特性上有一定差异.套捕型捕食线虫性真菌代表种为少孢节丛孢菌菌株(ArthrobotrysoligosporaStrain,A1),可产生菌环,菌网捕食线虫性结构,以套捕方式杀灭线虫幼虫(图 1).还有一种是梨形指环菌(DactylariapyriformisStrain,D1)菌株,可产生大量厚垣孢子(厚壁孢子). 厚垣孢子多数位
13、于菌丝中间,呈插人性生长,是在菌丝生长到一定阶段后出现的,出现的时间较分生孢子出现的晚,一般对不良环境的抵抗力较强(图 2).粘捕型捕食线虫性真菌代表种为纺锤隔指孢菌(Dactylellaellipsospora).可形成菌结捕食线虫性结构,以粘图 l 被少孢节丛孢菌套捕的线虫幼虫捕的方式杀灭线虫幼虫(图 3).图 2 梨形指环菌厚垣孢子图 3 纺锤隔指孢西及被捕获的线虫2.3 捕食线虫性真菌分布规律见表 1 和表 2.经 t 检验 ,土壤中第 2 组和第 3 组差异不显着,表明干燥土壤和沙土样土壤分出率没有明显差别.土壤中第 1 组和第 2,3 组差异显着,表明捕食线虫性真菌主要存在于潮湿,
14、阴暗,腐植质较多的环境中.而且在温暖季节,从树木下,花园,果园等地方的土壤中容易分出.粪便和土壤分出率差异显着,表明土壤和粪便相比,较易分离出此类菌,且反刍动物粪便中比马属动物粪便中捕食线虫性真菌分出率高.表 1 不同采样捕食线虫性真茵分出率表 2 不同动物粪便捕食线虫性真茵分出率346 中国兽医 2003 年 7 月第 23 卷第 4 期 ChinJVetSciJuly2003Vo1.23No.43 讨论一般认为,捕食线虫性真菌种属的确定主要是根据分生孢子的形态特点1.但经我们观察认为:应根据分生孢子 ,捕食线虫性结构等多项形态学特征及某些生物学特性(如菌环,厚垣孢子的产生情况)来综合进行种
15、类的区分,似乎更为完善一些.梨形指环菌菌株产生的分生孢子数量不多,但能产生大量厚垣孢子,后者对不良环境抵抗力较强.据报道1,厚垣孢子在干燥条件下,可存活 2O 个月,而且具有抗消化液作用 ,经过动物消化道后仍保持存活,且其生长和捕食能力不受影响,因此,梨形指环菌菌株的分出为今后捕食线虫性真菌的临床应用研究,提供了一个基础.本试验结果表明,捕食线虫性真菌土壤分出率为45.55,粪便分出率为 25.OO,总分出率为 4O.41.培养基拟采用 0.4g/L 玉米粉琼脂培养基(CMA)为宜.首次分离可在培养基中加入双抗(青,链霉素),有利于抑制一些细菌的生长,提高分出率.另外,在分离过程中,必须加入线
16、虫第 3 期幼虫,其作用一是为捕食线虫性真菌提供食物来源,促使捕食线虫性真菌快速生长发育;二是诱导捕食线虫性真菌产生捕食性结构菌环,菌网或菌结等,以便于与其他真菌相鉴别.本试验捕食线虫性真菌分离率明显高于 Saumell 等“3.8 的结果.其原因可能是:(1)Saumell 等所用采样全是粪便,而本试验采样除粪便外,还包括土壤.由于捕食线虫性真菌在自然状态下主要存在于土壤中,且其中一部分经过动物消化道后不能存活,显而易见,粪便中的分出率自然会低.(2)本试验所用粪便样品是从地上采集的,且有些是陈旧的粪便.据 Hay 等 DT报道,粪便排出后几天 (一般 3d)地表植被中真菌就会进入粪便;土壤
17、线虫也可能携带真菌进入粪便 .而Saumell 等的采样是从牛的直肠中直接采取的,不存在土壤中真菌进入粪便的情况.(3)Saumell 等是用 2 水琼脂培养基进行分离培养,而本试验用的是 0.4g/L 玉米粉琼脂培养基.本次分离捕食线虫性真菌所用的 3 种土壤材料中,较湿润土壤分出率为 71.88;其余 2 种较干燥土壤则分别为27.27 和 37.5O,分出率较低.Sauracil 等 n 报道,雨季开始和结束时,捕食线虫性真菌最易分出.本实验室几年来分离培养捕食线虫性真菌的实践也说明,捕食线虫性真菌多生活在阴暗,潮湿,富含腐植质的土壤环境中.在夏秋温暖季节,一般从树木下,花园,果园等地方
18、的土壤中容易分出.分离培养结果表明捕食线虫性真菌这类宝贵生物资源在我国是很丰富的.通过本次试验,加深了对捕食线虫性真菌的生存环境,所需条件及分布规律的认识,为今后分离具有本地区特色,作用效果好的菌株,提供了必要的依据.参考文献:1NansenP,GronvoldJ,HenriksenSA,eta1.Intercationsbetweenthepredaciousfungusr06coligosporaandthirdstagelarvaeofaseriesofanimalparasiticnematodesJ.VetParasitol,1988.26:329337.2杨晓野.杨莲茹 ,刘珍莲.
19、寄生虫生物控制概述A.中国动物学会寄生虫学专业委员会第八次学术讨论会论文集c.哈尔滨:2001.38.41.3GronvoldJ,WolstrupJ,NansenP,eta1.NematodetrappingfungiagainstparasiticcattlenematodesJ.ParasitolToday,1993.9(4):13714O.4WallerPJ,LarsenM.TheroleofnematophagousfungiinthebiologicalcontrolofnematodeparasitesoflivestockJ.IntParasitol,1993.23(4):539
20、546.5LarsenM.FaedoM.WallerPJ.Thepotentialofnematophagousfungitocontrolthefree-livingstagesofnematodepar-asitesofsheep:surveyforthepresenceoffungiinfreshfaecesofgrazinglivestockinAustraliaJ.VetParasitol.1994,53:275281.6LarsenM,WolstrupJ,HenriksenSA,eta1.Invitrostressselectionofnematophagousfungiforbi
21、ocontrolofparasiticRematodesinruminantsJ.JHelminthol,1991,65:193200.7ManueliPR.WallerPJ,FaedoM.eta1.BiologicalcontrolofnematodeparasitesoflivestockinFiji:screeningoffreshdungofsmallruminantsforthepresenceofnematophagousfungiJ.VetParasito,1999.81:3945.8杨晓野,杨莲茹 ,刘珍莲,等.捕食线虫性真菌一一少孢节丛孢菌CIMH1 株捕食特性研究j.中国兽
22、医寄生虫病,1999.7(2):1417.9杨晓野,杨莲茹 ,刘珍莲,等.捕食线虫性真菌的形态学研究J.内蒙古农业大学,2001,22(1):9-12.1O杨晓野,杨莲茹 ,刘珍莲 ,等.捕食线虫性真菌分离培养及形态学研究J1.中国兽医,2002,22(2):175177.11JorgensenRJ.IsolationofinfectiveDictyocauluslarvaefromherbageJ.VetParasitoI,1975,(1):6167.12CookeRC,GodfreyBES.AkeytothenematodedestroyingfungiJ.FransBritMycolSo
23、c,1964,47(1):6174.13邵力平,沈瑞祥 .张素轩,等.真菌分类学 I-M.北京:中国林业出版社,1984.14杨莲茹,杨晓野 ,杨玉琴,等.捕食线虫性真菌的分离鉴定J.中国兽医寄生虫病,1999,7(1):20 21.15GronvoldJ,NansenP,HenriksenSA,eta1.InductionoftrapsbyOstertagiaostertagilarvae,chlamydosporeproductionandgrowthrateinthenematodetrappingfungusDuddingtoniaflagrans-J.JHelminthol,1996
24、,70:291297.16SaumellCA,PadilhaT,SantosC,eta1.NematophagousfungiinfreshfaecesofcattleintheMataregionofMinasGeraisstate,BrazilJ.VetParasitol,1999,82:217220.17HayFS,NiezenJH,MillerC,eta1.Infestationofsheepdungbynematodephagousfungiandimplicationsforthecontroloffreelivingstagesofgastrointestinalnematode
25、sJ.VetParasitol,1997,70:247254.中国兽医 2003 年 7 月第 23 卷第 4 期 ChinJVetSciJuly2003Vo1.23No.4347表达 H9 亚型禽流感病毒 HA 基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性冀德君,彭大新,刘红旗,陈素娟,吴艳涛,高崧,刘秀梵(扬州大学农业部畜禽传染病重点实验室,江苏扬州 225009)摘要:将表达 H9 亚型禽流感病毒 HA 基因重组鸡痘病毒疫苗连续传代至 3O 代,取第 1O,2O,3O 代重组病毒作为受检代次,进行外源基因片段的克隆与测序,以间接免疫荧光试验检验各代次的表达,并以第 1O,2O,3O 代重组鸡痘病毒疫
26、苗进行免疫保护效力试验.对各代次模板进行 PCR 反应,分别扩增出特异的 1.7kb外源基因片段,酶切住点与原始代次相同;各代次外源基因序列与原始序列相比,仅有 1 个碱基发生变化,不涉及氨基酸的变化;免疫荧光试验显示各代次均有显着表达;各免疫组在免疫后第 7,1O,14,2O 天的 HI 抗体效价(1og2)逐渐上升;攻毒后第 5 天各免疫组排毒率与对照组相比差异显着,各免疫组之间无显着差异.结果表明:此重组栽体疫苗具有较好的遗传稳定性,经过 3O 代的传代后外源插入基因及其表达未见变化,免疫保护效力亦与原代一致.关键词:遗传稳定性;重组鸡痘病毒疫苗;血凝素;传代中圈分类号:$852.5;$
27、852.65 文献标识码:A 文章编号:10054545(2003)04 034703禽流感(avianinfluenza,AI) 是由 A 型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征】,可给养禽业尤其是养鸡业造成严重的损失,目前只能采取疫苗接种来预防.本实验室根据近年来禽流感血清学调查的结果,选用优势株 F 株(H9N2)研制成功表达 H9 亚型禽流感病毒 HA 基因的重组鸡痘病毒疫苗,初步的动物试验显示其具有较好的免疫保护效力.0IE 和 兽医生物制品规程 规定,用于兽医生物制品制造和检验用的菌(毒) 种均应有一定的使用代次限制2.因此,对此重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性,包括外源基因的序列,表达以及生物学活性等方面的内容进行研究.
