1、龟甲提取物对骨髓间充质干细胞增殖过程中核受体的影响2006 年 3 月第 23 卷第 2 期广州中医药大学March2006,Vo1.23.No.2JournalofGuaI1gzhOtlUniversityofTraditionalChineseMexlicine95文章编号:10073213(2006)02 009506龟甲提取物对骨髓间充质干细胞增殖过程中核受体的影响宋述财,许华,周健洪,黎晖,李伊为,杜少辉,陈东风(1.广州中医药大学,广州 510405;2.广州中医药大学第一附属医院 ,广州 510405;3.深圳市中医院,广东深圳 518033)摘要:【目的】观察龟甲(也称龟版或龟
2、板)提取物对骨髓间充质干细胞(mesenehymalstemcells,MSCs)增殖过程中核受体(flueearreceptor,NR)表达的影响.【方法】采用密度梯度法分离大鼠 MSC 进行培养,经 5 一溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记和CD44 免疫组化染色鉴定后,分别以高,中,低剂量的龟甲提取物 (3333,333.3,33.33n 正)加入到体外培养的 MSC 中,与龟甲提取物作用 12,24,72,120h 后,采用免疫组化法和免疫荧光细胞化学法检测MSC 的视黄酸受体(retinoicacidreceptor-a,RARG),维生素 D 受体(vitaminDreceptor,VD
3、R),雌激素受体(estrogenreceptor,ER),糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor,GR),甲状腺激素受体(thyroidhormonereeeptor-a,TRa)和过氧化物酶体增殖物活化受体(pemxisomepmliferatoractivatedreceptor-,PPAR)的表达.【结果】高,中,低剂量龟甲提取物组的 MSC 的 RARa,VDR 表达阳性细胞均高于对照组(P0.05 或 P0.01),且呈剂量依赖性;作用 24h 后 RARa 表达达峰值,作用 72h 后 VDR 表达达峰值.未检测到 ER,GR,PPAP,TRa 阳性反应细胞
4、.【结论】视黄酸受体 n 和维生素 D 受体可能为龟甲提取物促 MSC 增殖的药理靶点.关键词:龟甲提取物/药理学;骨髓间充质干细胞/药物作用;细胞增殖; 核受体/病理学;细胞培养;大鼠中图分类号:R285.5 文献标识码:A前期工作发现,龟甲(也称龟版或龟板)在体内,外可以促进骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的增殖并诱导 MSC 分化为神经元样细胞 l1_2J,经过较长时问诱导后 MSC 还可能向成骨方向分化 l_3J.提示龟甲一方面可以促进 MSC增殖,另一方面可能启动 MSC 向神经方向和成骨方向分化,证实了“肾主发育 ,主骨,生髓“ 的中医基础理论
5、.为进一步确定龟甲有效部位,我们采用递增极性溶剂洗脱方法,分离并筛选获得促 MSC 增殖的龟甲提取物.但龟甲提取物是通过什么途径产生上述作用?其作用靶点是什么? 核受体作为一类转录因子,其本身可被特异配体(天然或人工合成)激活或抑制的属性使它成为药物作用很好的靶标.继G 蛋白耦联受体和离子通道之后,核受体已成为第三大类非酶性治疗靶点.视黄酸受体(RAR)及维生素 D 受体(VDR)是核受体超家族的重要成员,对人体的生长发育起着重要的作用_4j.龟甲提取物促 MSC 增殖作用是否可能与核受体有关 ?我们采用免疫组化法和免疫荧光细胞化学法,观察了龟甲提取物对体外培养的 MSC 增殖过程中核受体表达
6、的影响,筛选促 MSC 增殖的药理靶点 .现报道如下.1 材料与方法1.1 试剂与仪器细胞培养及免疫组化试剂:D.Hanks 液(1x),不含钙镁离子,L.DMEM, 含1000mg/L 葡萄糖的 lx 液体,Percoll 和胎牛血清(FBS)均为 GIBCOL 公司产品 ;抗体兔抗 CD34,CD44,CD45,生物素化二抗(羊抗兔),链霉亲和素生物素复合物(SABC),二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒均购自武汉博士德公司;四甲基偶氨唑盐(MTr)为 SIGMA 公司产品;含血清完全培养基为补充体积分数 10%FBS 的 L-DMEM 培养液,同时添加 100kU/L 青霉素,100mg/
7、L 链霉素;2.5L 胰蛋白酶一 1mol/LEUFA 混合消化液;糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor,GR),视黄酸受体(retinoicacidreceptor-a.a),过氧化物酶体增殖物活化受体(pemxisomepmliferatoractivatedreeeptor-,PPAI)试剂盒均由北京博奥森生物技术有限公司(BIOS)提供;VDR,甲状腺激素受体(thyroidhormonereceptor-a,TRa)试剂盒由 SantaCmz收稿日期:20051202作者简介:宋述财(1963 一),男,副教授基金项目:国家自然科学基金项目(编号:302716
8、77,30371837,30472272); 广东省自然科学基金项目(编号:31483);广东省中医药管理局项目(编号:2050025)广州中医药火学 2006 年第 23 卷Biotechnology,Inc.Europe 提供;雌激素受体(estrogenreceptor,ER)试剂盒由博士德公司(BOSTER)提供.1.2 动物清洁级 SD 大鼠 10 只,1.52 月龄,雄性,体质量 80120g,由广州中医药大学实验动物中心提供(粤检证字 2003A010 号).1.3 龟甲提取物的制备将龟甲低温粉碎成粗粉,以体积分数为 95%的乙醇渗滤法提取,回收溶剂得到乙醇提取物,采用石油醚:乙
9、酸乙酯递增极性溶剂洗脱,得到龟甲提取物,不溶于水,二甲基亚砜溶解后配置成不同浓度的溶液.1.4MSC 分离,扩增与鉴定 _5_5 将大鼠骨髓用 I 一DMEM 冲出,充分混匀,转入离心管,以 300g 离心 10min,去上清,DHanks 重悬,离心去上清后,加 4mLD.Hanks 混匀;Percoll 贮存液按体积比为0.56:0.44 混合,取 4mL 放人 10mL 离心管内,吸骨髓液在离液面 2cm 处贴管壁缓缓加入;水平离心机以 900g 离心 30min,收集单核细胞层,用DMEM 洗涤 2 次;计算细胞数,调整密度,按 1X106/cm2 密度接种,37,5%饱和湿度的 c0
10、,孵箱培养,培养液为含体积分数为 10%FBS 的 LDMEM,3d 后更换培养液,弃去未贴壁细胞,23d 换液 1 次,接近融合的 MSC 用含 2.5I 胰酶室温消化 23min,按 1104/cm2 传代,传至第 3 代得到 1Xlo7/cm2 个细胞;将部分 MSC 接种至带盖片的 24 孔培养板内,滴加含体积分数为 10%FBS的 DMEM 培养液,2h 后细胞处于贴壁未分化状态,取出盖片做 5 一溴脱氧尿嘧啶(Brdu),CD44 免疫组化及两者结合的免疫组化双重染色.1.5MSC 的分组培养将传 3 代后的 MSC 种植于24 孑 L 板,分为空白对照组,龟甲低剂量组,龟甲中剂量
11、组和龟甲高剂量组.空白对照组为DMEM培养液,龟甲组为 bDMEM 培养液+龟甲提取物.根据预实验结果,分别称取龟甲提取物 33.33mg,溶于 1ilrL 二甲基亚砜(DMSO)中,即为龟甲提取物 33.33mg/mL 供试液,1mI/孑 L 培养基,龟甲低,中,高剂量组的剂量分别为 33.33ug/mL,333.3ug/L,3333mL.1.6 核受体检测参照试剂盒操作方法,分别在龟甲提取物作用 0,12,24,72,120h 后,采用免疫组化和免疫荧光细胞化学法检测 MSC 的 RARa,VDR,ER,GR,PPAR和 TRa 的表达.1.6.1 免疫组化反应新鲜配置体积分数为 3%的H
12、2(2,室温浸泡 510min 以灭活内源性过氧化物酶;滴加正常山羊血清 30min;分别滴加鼠抗RARa,VDR,ER,GR,PPAR8 和 TRa 一抗(1:2000),恒温下(37 )孵育 2h,PBS 洗;滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG(博士德二抗试剂盒 )室温下 30rain;滴加试剂 SABC,室温 30rain,DAB 显色,室温下 20rain,脱水,透明,中性树胶封片.染色对照:同一组片中,分别用正常山羊血清和PBS 代替 RARa,VDR,ER,GR,PPAR和 TRa 一抗作孵育,其余步骤同上.1.6.2 免疫荧光细胞化学法细胞爬片用 4oL多聚甲醛固定 15rain,再
13、放人体积分数为 3%的过氧化氢一甲醇溶液中,室温 10rain,以正常山羊血清封闭 20rain,分别加入 RARa,VDR,ER,GR,PPAR,TRa 一抗在 4C 过夜,然后与生物素化的二抗 37 下孵育 2030min,再与链霉亲和素一异硫氰酸荧光素(SABCFITC)在 37 下孵育 20rain,碘化丙啶(PI)复染.1.7 统计学处理随机取 5 张阳性细胞染色爬片,在显微镜下(20 倍) 随机选 1O 个视野对每张爬片汁算阳性细胞数,取其平均值.所得数据采用SPSS11.0 统计软件进行分析处理,两样本问比较采用 t 检验,组问比较采用方差分析.2 结果2.1 不同剂量龟甲提取物
14、对 RARa 表达的影响空白对照组 MSC 的 RARa 表达为 0,无阳性细胞,胞核红色,无阳性反应(阳性反应为绿色)(图1 一 a);龟甲低,中,高剂量组 MSC 的 RARa 表达均明显增高,且呈浓度依赖性(表 1),胞核呈红色荧光和 RAR 阳性反应(绿色),数量呈剂量依赖性增多(图 1 一 b,c,d),而高剂量组的 RARa 表达水平与中剂量组表达水平相当,无显着性差异,提示中剂量组(333.3fzg/mL)可能是激活细胞内信号通路或 RARa 受体的适宜浓度.2.2 不同作用时间的龟甲提取物对 RARa 表达的影响采用 333.3/g/mL 龟甲提取物分别作用 0,12,24,7
15、2,120h;作用 12h 后,MSC 的 RARa 阳性反应细胞开始增多,随着作用时间增加,RARa表达增强;作用 24h 后,MSC 的 RARa 阳性反应达峰值(表 2,图 2 一 b,c,d);空白对照组 MSC 仍无阳性细胞(图 2 一 a).2.3 不同剂量龟甲提取物对 VDR 表达的影响空白对照组 MSC 的 VDR 的表达极低 ,龟甲低,中,高剂量组 MSC 的 VDR 表达均明显增高 ,且呈浓度依赖性(表 1),胞核 VDR 阳性反应(绿色)明显增多,且呈剂量依赖性(图 3 一 b,c,d).2.4 不同作用时间的龟甲提取物对 VDR 表达的影响采用 333.3/g/mI 龟
16、甲提取物分别作用 0,12,24,72,120h;作用 24h 后,MSC 的 VDR 阳性反第 2 期术述财,等.龟甲提取物对骨髓间充质干细胞增殖过程巾棱受伴的影响 97应细胞开始增多,随着作用时问增加,VDR 表达增强,空白对照组有少量 VDR 阳性反应细胞(图 3一a);作用 72h 后,VDR 表达的峰值为 14.60.5(表 2,图 4 一 b,c,d),呈时效依赖性.表 1 不同剂量龟甲提取物对 MSC 的 RAFkx,VDR 表达的影响Table1EffectofECPTindifferentdOsagesonRAFkxandVDRexpressioninMSC(s)胜 fal/
17、(个-视野一):P0.05,:P0.01,与空白对照组比较(theblmcontrolgroup)(下)2.5 龟甲提取物对 ER,GR,PPAR,TRa 表达的影响免疫组化和免疫荧光方法均检测不到 ER,GR,PPARB,T 阳性反应细胞.提示 ER,GR,PPAR3,TRa 在龟甲促 MSC 增殖过程中可能无作用.表 2 中剂量龟甲提取物于不同作用时间对 MSC 的RARa,VDR 表达的影响Table2Effectofmoderate-doseECPTOnRARaandVDRexpressioninMSCatdifferenttimepoints()n 胞/(个? 视野一)a.空白对照组
18、 (blank)b.低剂量组(1owdoseECF!)c.中剂量组(rnoderate.doseECFI)d.岛剂量组(high-doseECPF)图 1 不同剂量龟甲提取物作用 MSC12h 后 HA表达的比较(免疫荧光细胞化学法,4OO)Figure1RARerexpressioninMSCafter12hourculturewithECPT(byimmunofluorescencerneth,4OO)a.空白对照组 (blank)b 低刹墩组(1ow.doseEcPrr)e.中剂量组(merate-doseEcFr)d 高剂鼙组(high-r】0ECPT)图 2 不同剂量龟甲提取物作用
19、MSC24h 后 HAm 表达的比较(免疫荧光细胞化学法,4OO)Figure2RAFkxexpressioninMSCafter24?hourculturewithECPT(byimmunofluorescencemeth,X40O)a 空白对照组 (blank)b.低剂鞋组(1ow-flECPT. 中剂组(rnrxlera.Ie-doseECIrl“)d.高剂量组(high-doseECPT)图 3 不同剂量龟甲提取物作用 MSC24h 后 VDR 表达的比较 (免疫荧光细胞化学法,X400)Figure3VDRexpressioninMSCafter24-hourculturewithE
20、CPT(byimmunofluorescencemethod,X400)98 州中医药大学 2006 年第 23 卷一一一一 a.空白对照组 (blank)b.低剂量组(1ow-doseECFF)c.中剂量组(moderatedoseECFF)d.高剂量组 (hi 一 doseEcrr)图 4 不同剂量龟甲提取物作用 MSC72h 后 VDR 表达的比较 (免疫荧光细胞化学法,400)Figure4VDRexpressioninMSCafter72-hourculturewithECPT(byimmunofluorescencemethod,400)一一一一 a.空白对照组 (blank)1)
21、.低剂量组(1ow-doECPT).中剂量组(moderate dnseEcer)d.高剂帚组(higI 一1f1seECPI)图 5 不同剂量龟甲提取物作用 MSC24h 后 RARa 表达的比较 (免疫组化法,400)Figure5RAP,orexpressionInMSCafter24 一hourculturewithECPT(byimmunohistochemistrymethod,400)一一一一 a.空白对照组 (blank)h 低剂量组(1ow-doECFF)(-.中剂量组(moderate-doseECPT)d.高剂量组(highdoseECPT)图 6 不同剂量龟甲提取物作用
22、 MSC72h 后 VDR 表达的比较 (免疫组化法,400)Figure6VDRexpressioninMSCafter72-hourculturewith 日:PT(byimmunohistochemistrymethod,400)3 讨论龟甲益肾作用与细胞增殖密切相关.细胞增殖是细胞生命的一个基本特征.与机体的生长,生理性再生,创伤修复,程序化细胞死亡及肿瘤发生都有密切关系,它也是细胞分化形成组织,器官,系统的基础 6.中医基础理论认为,肾主发育,肾藏“先天之精“, 直接关系着机体的强弱,并调控机体的生长,发育和生殖,故称之为“先天之本“. 素问-上古天真论描述:“ 女子七岁,肾气盛,齿
23、更,发长丈夫八岁,肾气实,发长齿更“,说明肾控制了机体组织细胞的生长发育;灵枢-经脉云:“ 人始生 ,先成精,精成而脑髓生.“ 龟甲成,甘,平,入肾经,滋阴补肾之力强.肾阴是人体阴液的根本,对各脏腑组织起着濡润,滋养作用,肾阴充盛,则主持人体生长,发育作用.Elizabeth 等 lI 从发育生物学角度研究 ,龟 Ef因其特殊的发育生成方式,含有外胚层发育的有关成分如骨形成蛋白等.前期研究显示,滋阴益肾中药龟甲可以促进体内干细胞的增殖【mj.本研究所采用的龟甲提取物为脂溶性成分,有可能通过扩散直接透过细胞膜,与 MSC 核内的受体结合调节基因表达.龟甲对 MSC 增殖作用是否可能通过激活核受体
24、来实现的? 为了证实这一假设 ,我们采用免疫组化和免疫荧光方法对目前已知核受体进行龟甲提取物促 MSC 增殖作用的药理靶点筛选 .核受体是一类与 DNA 应答元件结合加配体激活性转录调控因子,它们的主要功能是特异性调控发育,生殖,代谢相关基因的表达_4j.已知哺乳动物核受体分为 3 类:(1) 甾体激素受体家族 ,包括糖皮质激素,雌激素受体;(2)非甾体激素受体家族,包括视黄酸受体,维生素 D 受体和甲状腺激素受体;(3)具有核受体的基本特征但却未找到它们的配体,也不知道它们的靶基因和生理功能,因第 2 期宋述财,等.龟甲提取物对骨髓间充质干细胞增殖过程中核受体的影响 99而将它们称为孤儿受体
25、,例如过氧化物酶体增殖物活化受体 lI1J.本研究结果表明,龟甲提取物能时效和量效依赖性地促进 RA 的表达.MSC 是造血微环境的重要组成部分,它们通过分泌细胞因子与细胞问相互作用,影响造血干细胞的自我更新和增殖 l】.视黄酸受体在细胞增殖,分化,视觉,组织维持,胎儿发育,繁殖等过程中发挥着重要作用,lIAR 在不同组织发育阶段不同程度地表达 l_l.RARa 与机体造血功能密切相关,在成熟造血细胞中 RARa 基因有高度表达.龟甲入肾,肝经,补肾填精,生髓补血,可能通过调控 lIAR 的表达达到促进MSC 增殖,改善造血微环境的作用 .本实验观察到,经龟甲提取物作用后,MSC 的 RARe 表达显着增强,且呈浓度依赖性增高,推测龟甲提取物可能激活了 RARa,使其从无活性状态转变成活性状态参与靶基因的转录调控,这可能是龟甲促使 MSC向神经干细胞转化的机制之一.本研究也表明,龟甲提取物能时效和量效性促进 VDR 的表达.维生素 D(VitD)是钙平衡和骨代谢的主要调节因子.新近研究表明 VitD 不仅影响钙磷代谢,而且具有广泛的重要的生理功能,有人
