1、高速毛细管电泳技术第 23 卷第 2 期2004 年 3 月分析91l 试FENXICESHIXUEBAO(JoumalofInstrumentalAnalysis)Vfd23No.2l04lO9/综述e,!,似 “高速毛细管电泳技术杨冰仪,莫金垣(1.中山大学化学与化学工程学院,广东广卅 l510275;2.广东药学院预防医学系,广东广卅 I510224)摘要:高速毛细管电泳技术(HSCE)的特点在于通过增大分离高压和缩短毛细管,将分析速度提高到几秒至几分钟内;近几年 HSCE 得 NT 较大的发展;本文着重介绍了高速毛细管电泳技术的理论,进样方法,检测器及其在各个领域的应用.关键词:高速毛
2、细管电泳;评述中图分类号:0657.63 文献标识码:A 文章编号:10044957(2004)02010406HighspeedCapillaryElectrophoresisYANGBingvi.2,MOJinyuan(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SunYatsenUnivety,Guangzhou510275,China;2.GuangdongCollegeofPharmacy,Cuangzhou510224.China)Abstract:Thecharacteristicofhighspeedcapillar3electropho
3、resis(HSCE)liesinthefeasibilitytoim-provetheseparationspeedwithinseveralsecondsorminutesbyincreasingthevoltageandshorteningthelengthofthecapillary.Inrecent)ears,HSCEhasmadegreatprogress.Inthisarticlethetheory,detection,sampleinjectionofHSCEanditsapplicationinvariousfieldsareintroduced.Keywords:Highs
4、peedcapillaryelectrophoresis;Review毛细管电泳(CE) 是近年来发展最迅速的分离分析手段之一.由于 CE 具有高效(理论塔板数大于 10/m),快速(分析时间小于 30rain),进样体积小(一般为 nL 级),溶剂消耗少和样品预处理简单等优点,自八十年代问世以来,在化学,环境,生命科学等领域都有广泛应用.通常,CE 中采用柱长 50100cm,内径 50100m 的毛细管,分离高压一般小于300V/cm.分析时间一般在 530min,许多场合这个时间仍不能满足分析要求,如化学动力学研究,寿命短暂物质的分析,生化反应过程研究等.因此在保持 CE 高效等优点的前
5、提下 ,提高 CE的分析速度是CE 技术发展面临的一个挑战.1991 年 Jorgenson 和 Monnig首次提出了高速毛细管电泳 (highspeedcapillaryeleetrophoresis 或 fastcapillaryeleetrophoresis,HSCE 或 fastCE)技术,即采用细内径和较短的毛细管来实现高速分离.高速毛细管电泳可以实现真正的高效,高速,除了保持 CE 原有优点外,其分析时间缩短至几秒到几分钟,因此是一种能满足现代分析要求,具有发展潜力的分析技术.HSCE 自诞生以来,经过各国学者的努力,已经在各个领域,特别是生命科学领域,得到了飞跃的发展.近几年来
6、芯片毛细管电泳技术是 CE 的一大热点.芯片毛细管电泳技术实质上是将 HSCE 的仪器微型化,HSCE 的理论同样适用于芯片技术 ,可以将芯片技术当作 HSCE 的一个分支来讨论.已有关于芯片毛细管电泳及其在生命科学中的应用方面的综述.但芯片毛细管的加工需要采用蚀刻技术,一般的实验室不具备此条件;而采用细内径和较短的毛细管来提高 CE 分析速度的 HSCE 方法较之简单易行,无论是采用商品或自组装的 CE 仪都可以实现 .因此在这里重点讨论通过缩短毛细管和增大分离场强来提高分析速度的 HSCE 技术.下面将主要介绍 HSCE 的理论,进样方法,检测器及其在各个领域的应用.收稿日期:200303
7、20;修回日期:2O04 一 O106基金项目:国家自然科学基金资助项目(2%75033);广东省自然科学基金资助项目(001237)作者简介:杨冰仪(1973 一),女,广东普宁人,讲师.博:研究生; 莫金垣,联系人.第 2 期畅冰仪等:高速毛细管电泳技术1 基本理论1.1 理论基础如果溶质纵向扩散是区带展宽的唯一因素,对于 CE 来说,可以通过增大分离高压和缩短毛细管来提高速度,同时兼顾分离效率.CE 中组分的迁移时间 tmig 和理论塔板数的关系可以用以下方程表示:t:?(1)rrLiE一 2DL/,L.毛细管总长;V.总分离高压;.表观电泳迁移率;N.理论塔板数;D.溶质的扩散系数.从
8、式(】 )可以看出 ,在任何给定的时间内要获得最高的理论塔板数,分离电压与毛细管长度的比例应该最大,也就是说在只考虑溶质纵向扩散的前提下,采用尽可能高的分离电压和短的毛细管,可以实现高柱效和快速分离.高电渗流同样可以提高分析速度和柱效.1.2 焦耳热但实际上,分离高压增大和毛细管长度缩短时,除了扩散外,还有诸多因素影响柱效,其中最严重的是温度效应,即毛细管的焦耳热问题,这是 HSCE 中不可忽略的问题.毛细管在高压场下产生的焦耳热 G(单位:W/m) 可以表示为I:G()(2).电导率;r.毛细管内径.式(2)表明,焦耳热随着分离高压增大和毛细管的缩短而增大.焦耳热过大会造成峰扩展,变形.1.
9、3 减少焦耳热的方法理论上,当 G 小于 1W/m 时,焦耳热造成的峰扩展可以忽略不计.从式(2)可以看出,在,L一定情况下,减少 r,可以降低 G.也就是说,采用小内径毛细管可以降低焦耳热,施加高电压,实现快速分离而不影响柱效.在 HSCE 的许多实例中,通常采用内径低至 10m 的毛细管和 25kV/cm的高电场.但内径低于 50t,tm 的毛细管对进样和检测提出 r 更高的要求.另一种减少焦耳热的方法是采用低电导率的缓冲溶液,如具有高的相对分子质量,小电荷的溶液或窄 pH 范围的两性电解质.这种方法很有吸引力,因为它对仪器没有特殊要求 ,可以应用于商品 CE仪上.Hjerten 等采用聚
10、氧乙烯双(3 氨基 2.羟基.正丙基)和聚氧乙烯双(乙酸)缓冲溶液及 50m 内径的毛细管,在 25S 内分离了 4 种羧酸,分析速度提高了 5 倍而且不会降低柱效.综上所述,要在维持高效情况下加快 CE 的分析速度 ,可以采用以下几种方法:(1)短而窄内径的分离毛细管;(2) 高分离电压 ;(3)高电渗流.另外,对于带负电荷的分析物,通常在缓冲溶液中加入阳离子表面活性剂,通过改变 E0F 的方向来提高分析速度.2 仪器装置2.1 检测器由于采用细内径毛细管,进样量通常小至几个皮升(10L),因此 HSCE 需要相应高灵敏度的检测器.同时,为了将分离毛细管导致的区带展宽减至最小,HSCE 技术
11、应当采用在柱检测.以下介绍几种适用于 HSCE 的检测器 .2.1.1 激光致荧光检测器 flaser.inducedfluorescencedetection,LIFD)LIFD 是 HSCE技术中最常用的一类检测器.LIFD 采用的激光可以聚焦至毫米级大小的范围 ,从而减少检测器造成的峰扩展;同时 L【F1)十分灵敏,适用于小内径毛细管.曾有人采用 LIFDHSCE 对单个分子进行测定】.LIFD 的局限在于大部分的化合物都不具有荧光性 ,因此需要使用衍生试剂对分析物进行荧光标记后才可分析.2.1.2 安培检测器 famperometricdetection,AMD)AMD 具有很高的灵敏
12、度,适用于HSCE.需要考虑的是电极大小,毛细管的连接(离柱检测)及毛细管与电极的放置(柱端检测)所造成的区带展宽分析测试第 23 卷问题.使用芯片技术结合电化学检测是实现快速分离的一种较好形式.woolly 等18用阵列的 Pt 工作电极在 100s 内分离了 3 种电活性小分子.AMD 的局限在于电泳电流较高,产生的噪音较大.2.1.3 光学检测器(aborf)ancedetection,AD) 紫外一可见吸收检测器是 CE 中最常用的,但却不适合 HSCE.HSCE 中采用短而窄内径的分离毛细管 ,吸收太小而无法检测 .使用矩形毛细管可以解决这一问题,而且矩形毛细管比相同表面积的圆柱形毛
13、细管具有更好的散热能力.另一个方法是使用光热吸收检测器(thenno0pticalaborbaneedetection,TOAD). 采用两束激光交叉通过分离毛细管的检测端;一束与被测物的吸收轮廓相匹配,另一束长波用于监测毛细管内溶液的折射指数变化.当样品进入检测端时,吸收第一束激光的辐射,导致折射指数发生变化,被第二束激光检测.比起其他光学检测器,TOAD 检测不会发生区域展宽.Yu 等此法检测蛋氨酸 ,检出限为37amol(10 一 -s):Bmo等用 25/zm 的毛细管检测了 350Pg 的样品.2.1.4 质谱检测器(massspectrometrydetection,MSMS 能够
14、提供试样的结构信息,为解决复杂体系中痕量或微量物质的分析提供广阔的前景.Ms 用于 HSCE 一个需要解决的问题是 CE 与 MS 的接口.理想的 cEMs 接口应该能够在维持 cE 高压的状态下将分析物传递到质谱仪中.电子喷雾(eleetrospray)是最佳选择.实践证明飞行时间(timeoffight,TOF)质谱最适用于HSCE,因为TOFMS 可以在毫秒级的时间范围内获得光谱信息,可以满足 HSCE 的分析要求.LaZ 等 I171 采用TOFMSHSCE 检测多肽,获得飞摩尔级(10-9 的检出限 .2.2 进样系统HSCE 需要相应快速的进样方法,传统的 cE 流体力学和电动进样
15、方法不能满足HSCE 的要求 .研究表明,对于吸附性不是很强的小分子来说,进样方式是导致 HSCE 峰扩展的最大因素 Il8l 一.CE 的初始区带宽度可以用方差表示为 I:h2/12,h.样品塞的初始宽度.为满足高速,高效分离测定,使进样系统引起的区带展宽减至最小,进样量必须是皮升级或更小.除了考虑样品塞的初始宽度外,样品负载(电迁移扩散)也是要考虑的另一个问题.这一问题可以通过采用低浓度样品,并将其溶解在电泳介质中来解决.下面介绍 HSCE 中常用的几种进样方法.2.2.1 光学门进样(opticattygatedCE)装置见图 1I.荧光标记后的样品在高压的驱动下进入分离毛细管,当样品到
16、达毛细管的“前门“(entrance)13,用第一束激光 (gatin:beam)来减灭大部分荧光标记的样品,只允许很窄宽度的样品塞通过,实现分离后用 LIF 检测.由于样品引入是采用光学形式而不是机械控制的,样品塞宽度很小,同时可以在维持高压状态下进样.用这种方法进样,4 种荧光标记的氨基酸可以在 140nls 内实现分离.由于进样量只有几个皮升,可获得高达 350000 塔板数的高分离效率,塔板高为nano(109)mfI.光学门进样的缺点在于:(I)这也是 1 种电动进样,因此存在进样偏向;(2)荧光减灭的效率较低,只有 8O%左右.2.2.2 流动门进样(flow-gatedCE)装置
17、见图 2.装载样品的毛细管与分离毛细管距离的间隙约 75/zm;开启流动泵时,样品毛细管出口处的样品被流动的缓冲溶液带走,无法进入分离毛细管;当流动泵关闭时,样品由于电动力学效应而被引入分离毛细管中.此法的标准偏差小于 4%,流动相流速控制在 79rI/nIL/min,特别适用于超微分析.用此法进样,4 种荧光标记的氨基酸可以在 35S 内实现分离,塔板数为 4800O0J.流动门进样不如光学门进样更适用于 HSCE 中 ,因为流动泵的开闭需要消耗一定时间,使总voltage图 1 光学门进样装置示意图Fig.1SchematicdiagramoftheOpticalgatingsystemW
18、Gating-flowpumpSampleStreamWaste图 2 流动门进样装置示意图Fig.2Schematicdiagramofthenowgatesystem第 2 期畅冰仪等:高速毛细管电泳技术分析时间增加.但它的装置简单,低廉,而且可以在维持高压状态下进样.2.2.3 进样阀系统(injectionvalvesystems) 进样阀系统的进样方式类似 HPLC 的进样方式,样品毛细管和分离毛细管的对准方式则类似流动门进样系统.样品首先通过一个类似HPLC 的进样阀门 ,然后阀门推动样品进入样品毛细管.这种进样方式特别适合超微分析,.2.3 平行电泳分离技术(parallelel
19、ectrophoresisseparation)HSCE 可以采用平行电泳技术来实现.Kheterpal【曾对平行电泳技术应用于基因分析作了综述.平行电泳技术包括毛细管束(capillau?bundles),开放通道(openchannels)和多通道芯片技术(multiplechannelsonchips)等形式.2.3.1 毛细管束(capillarybundles) 毛细管束是将许多根(大约 100 根) 毛细管并列组成毛细管阵列,同时插入同一个样品中,采用扫描【2 或电荷藕合阵列 CCD 作检测器,以实现每一根毛细管同时检测.近来有报导采用 1000 根毛细管 J.目前发表的毛细管束方
20、面应用均是人类基因工程组用于 DNA 排序分离.2.3.2 通道电泳(channelelectrophoresis)通道电泳中,分离在一个矩形的通道中进行.通道的厚度通常小于 20m,宽度 1.5em 左右,样品通过一个石英毛细管导入通道 ,分离后的样品采用 LF 埘或安培阵列电极检测.此法曾用于流动注射分析【】,动力学行为研究 I3i】,多维分析 I 弛和监测单细胞的分泌物】.3 应用HSCE 的应用包括寿命短暂物质的检测,小分子和离子分析,免疫分析和多维分析等.3.1 寿命短暂的蛋白质和多肽化合物的检测HSCE 特别适合寿命短暂物质的检测.蛋白质和多肽化合物的一些中间存在形式,例如包含脯氨
21、酸残余片段的多肽存在顺式和反式两种形式,顺式和反式的互相转化(异构化效应)在几秒至几分钟内完成,HSCE 是研究异构化效应的一种较好方法.见表 I.表 l 蛋白质和多肽化合物的 HSCE 检测TablelDetectionofshortlivedproteinandpeptideconformationsbyHSCE3.2HSCE 用于小分子和离子的分析HSCE 用于小分子和离子的分析包括无机离子,有机离子,有机酸,氨基酸,糖类,药物,手性分离等领域.见表 2.3.3HSCE 用于免疫分析HSCE 在免疫分析方面的应用归纳于表 3.3.4 其它方面的应用HSCE 技术的一个最有效的应用是多维分
22、离(multidimensionalseparation).多维分离技术可以采用TLC 平板,二维凝胶电泳或 2 根以上并列的分离柱.通常采用一维(反向液相色谱柱,RPLC),为了提高分析速度,也可以结合光学门进样或流动门进样方式;二维则进行 CE 的在线或离线分分析测试第 23 卷离.也有采用一维空间排斥色谱柱(SEC)进样,二维 RPLC 柱和三维 CE 分离系统621.多维技术可用于复杂样品的分析,如蛋白酶原631,生理体液 i62,641,人体血清中的蛋白质 159,圳等.表 2 小分子和离子的 HSCE 分析Table2DetectionofsmallmoleculesandionsbyHSCE表 3HSCE 用于免疫分析Table3HSCEbasedimmunoassaysHSCE 的应用还包括 DNA 的分析,包括测序,PCR 产物鉴定,基因突变研究,临床诊断等.见表 4.HSCE 还被用于研究生物体内的化学物质的代谢,食品,临床,环境等领域.Hogen等采用
