1、食品安全国家标准食品微生物学检验 创伤弧菌检验(征求意见稿)xxxx-xx-xx 发布 xxxx-xx-xx 实施中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB xxxxxxxx1食品安全国家标准食品微生物学检验 创伤弧菌检验1 范围本标准规定了水产品中创伤弧菌（Vibrio vulnificus）的检验方法。本标准适用于鱼、虾、蟹、贝类等水产品中创伤弧菌的检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：361 。2.2 冰箱：25 、 710。2.3 恒温水浴锅。2.4 均质器或无菌研钵。2.5 天平：感量 0.1 g2.6 PCR 仪。2.7
2、 电泳仪或毛细管电泳仪。2.8 凝胶电泳成像系统或紫外检测仪。2.9 生物安全柜。2.10 高速离心机（最大转速至少 15 000 r/min）。2.11 涡旋振荡器。2.12 微量可调移液器（量程 2.5 L、10 L 、100 L、1000 L）及配套吸头。2.13 pH 试纸或 pH 计。2.14 无菌试管：规格 18 mm180 mm 和 15 mm100 mm。2.15 无菌吸管：规格 1 mL（具 0.01 mL 刻度）和 10 mL（具 0.1 mL 刻度）。2.16 无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL 和 1000 mL。2.17 无菌培养皿：直径 90 mm。2.1
3、8 无菌手术剪、镊子、钳子等。2.19 PCR 反应管。3 培养基和试剂3.1 蛋白胨-氯化钠-纤维二糖-多粘菌素 E（PNCC）增菌液：见附录 A 中 A.1。3.2 纤维二糖-多粘菌素 E（ CC）琼脂：见附录 A 中 A.2。3.3 改良纤维二糖-多粘菌素 -多粘菌素 E（mCPC）琼脂：见附录 A 中 A.3。3.4 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录 A 中 A.4。3.5 磷酸盐缓冲液（PBS）：见附录 A 中 A.5。3.6 3%氯化钠三糖铁琼脂：见附录 A 中 A.6。3.7 嗜盐性试验培养基：见附录 A 中 A.7。3.8 3%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A
4、.8。3.9 3%氯化钠 MR-VP 培养基：见附录 A 中 A.9。3.10 3%氯化钠溶液：见附录 A 中 A.10。23.11 氧化酶试剂：见附录 A 中 A.11。3.12 革兰氏染色液：见附录 A 中 A.12。3.13 邻硝基酚-D-半乳糖苷（ ONPG）试剂：见附录 A 中 A.13。3.14 Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录 A 中 A.14。3.15 细菌 DNA 提取试剂盒。3.16 生化鉴定试剂盒。3.17 PCR 反应配套试剂。3.18 琼脂糖凝胶电泳配套试剂。3.19 具有菌种保藏资质单位提供的创伤弧菌标准菌株。4 检验程序创伤弧菌检验程序见图 1
5、。361，18h1h阳性者5 操作步骤5.1 样品制备5.1.1 新鲜样品采集后应于 3 h 内完成检验，若不能立即检验，则将样品置于 710冰箱（因创伤弧菌在 4条件下极易形成活而不可培养的状态，因此样品勿放 4）保存，并尽可能在 24 h 内完成检验；冷冻样品应在不超过 45的温热条件下解冻不超过 15 min。361，18h1h样品 25g(mL)+225 mL PNCC 增菌液PCR 初筛创伤弧菌挑取可疑菌落，接种于 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板初步鉴定：包括革兰氏染色、氧化酶试验、3%氯化钠三糖铁琼脂、嗜盐性试验生化试验结果与报告PCR 鉴定划线接种于 CC 平板和 mCPC 平板
6、PCR 分型（选做）阳性阴性361，18h1h图 1 创伤弧菌检验程序35.1.2 取样鱼类和头足类取其表面组织、肠和鳃，贝类则取全部内容物（包括贝肉和体液）。甲壳类取整个动物或其中心部分（包括肠和鳃）。如为带壳贝类或硬壳甲壳类，则应先用流动自来水冲洗外壳并用滤纸吸干表面水分，然后无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。5.1.3 以无菌操作取经上述处理后的样品不少于 25 g，用旋转刀片式均质器 8000 r/min10000 r/min 均质 1 min，或用拍击式均质器均质 1 min2 min 后，取 25 g 样品匀浆液置于均质袋中，加入 PNCC 增菌液 225 mL，充分混匀制备
7、成 1:10 的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中充分研磨，取磨碎后的样品 25 g 转入 500 mL 无菌锥形瓶中，加入 PNCC 增菌液 225 mL，充分振荡混匀，制备成 1:10 的样品匀液。5.2 增菌将 5.1.3 制备的 1:10 样品匀液于 36 1 培养 18 h1 h。5.3 PCR 初筛PCR 实验环境条件和过程控制应参照 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测规定执行，下同。5.3.1 DNA 模板的制备吸取 1mL PNCC 增菌液于 1.5 mL EP 管中，9000 r/min 离心 3 min，弃去上清液。向沉淀中加入 1mL
8、PBS 将其悬浮并充分清洗后，9000 r/min 离心 3 min，弃去上清液，按此步骤反复清洗沉淀 2-3 次，弃去最后一遍上清液，加入 1 mL 无菌超纯水，100煮沸 10 min，继而 12 000 r/min 离心 5 min，上清液用于 PCR 分析。若不能及时分析则于-20保存备用。也可以用商品化的 DNA 提取试剂盒按其说明书要求提取制备 DNA 模板。5.3.2 PCR 扩增（1） 引物信息见表 1。表 1. 创伤弧菌 PCR 检测用引物信息引物 序列 扩增片段长度vvhA-785F 5 ccg cgg tac agg ttg gcg ca 3vvhA-1303R 5 cg
9、c cac cca ctt tcg ggc c 3 519 bp（2）对照设置每次 PCR 反应使用创伤弧菌标准菌株作为阳性对照，同时，使用除创伤弧菌之外的其他革兰氏阴性菌标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照。（3） PCR 反应体系见表 2。表 2. 创伤弧菌 PCR 检测反应体系组成试剂 反应体积（L）无菌超纯水 13.710PCR 缓冲液 2.525 mmol/L MgCl2 2.5 2.5 mmol/L dNTP 2.0上游引物（10M） 1.04上游引物（10M） 1.0DNA 模板 2.05 U/L Taq 酶 0.3总体积 25.0（4） PCR 反应程序预变性：94
10、、 5 min；变性： 94、1 min，退火：62、1 min，延伸：72、1 min；循环数：30；终延伸：72，10 min；电泳检测。若不能立即检测则 4保存备用。5.3.3 电泳凝胶电泳检测 PCR 扩增产物。用 0.5TBE 缓冲液配制 1.5%的琼脂糖凝胶（含 EB 0.5 g /mL 或 Goldview 5 L /100 mL），取 5 L PCR 扩增产物与 1 L 6核酸电泳上样缓冲液混合后，点样，同时有一孔加入 DNA 分子量标准。根据以下公式：电泳槽正负极的距离（cm ） 5 V/cm 计算并设置电压，使用 0.5TBE 缓冲液恒压电泳，根据溴酚蓝的移动位置确定电泳时
11、间，使用凝胶成像系统或紫外检测仪观察和记录结果。也可采用毛细管电泳仪进行 PCR 扩增产物的检测。5.3.4 结果判定质控系统：阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小（519 bp）的扩增条带，则检测系统正常。否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验，同时排除污染因素。阳性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品出现预期大小（519 bp）的扩增条带，判定 PCR 结果为阳性。阴性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品未出现预期大小（519 bp）的扩增条带，判定 PCR 结果为阴性。5.4 分离用 10 L接种环在距离 PNCC 增菌液的液面下 1 cm 沾取一环增
12、菌液，分别划线接种于 CC 和 mCPC 平板，于 36 1条件下培养 18 h1 h。典型的创伤弧菌在 CC 和 mCPC平板上的形态为：圆形、扁平，光照下透明或中心不透明但边缘透明的黄色至橘黄色菌落，菌落直径 1mm2 mm，菌落周围可出现（或不出现）黄色晕圈。5.5 分纯培养从 CC 平板和 mCPC 平板上各挑取至少 5 个创伤弧菌可疑菌落（少于 5 个时全选），分别接种于 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板， 361 培养 18 h1 h 后用于后续鉴定。创伤弧菌在 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的菌落形态为圆形，乳白色，湿润，隆起，直径 1mm2 mm。5.6 鉴定创伤弧菌的鉴定可采
13、用菌落特征结合生化特性、PCR 方法中的其中之一进行。5.6.1 菌落特征及生化特性5.6.1.1 初步鉴定该步骤用于创伤弧菌的初步鉴定，进行以下四项鉴定实验时，挑取的菌落应来自分纯后的同一个单菌落，其中任一项鉴定为阴性者无需进行后续确证试验。革兰氏染色镜检：从 5.5 中 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落进行革兰氏染色并镜检。创伤弧菌为革兰氏阴性，显微镜下菌体为棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞。5氧化酶试验：用接种环从 5.5 中 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落适量，涂布在用氧化酶试剂湿润（如无菌滤纸）或滴有氧化酶试剂的白色或无色载体（如载玻片）上
14、。如果涂菌部位在 10 s 之内变紫色（偶有蓝紫色），即为氧化酶试验阳性，不变色为氧化酶试验阴性。创伤弧菌为氧化酶试验阳性。 三糖铁试验：用接种针从 5.5 中 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落适量，转种于 3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层（注意接种针不要触及试管底部），36 1培养 24 h 观察结果。创伤弧菌在 3%氯化钠三糖铁琼脂斜面中生长时试管底层变黄，无气泡，斜面颜色变黄（偶有斜面颜色不变黄的现象）。嗜盐性试验：用接种针从 5.5 中 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落，分别接种于含 0%、3%、6%、8% 和 10%氯化钠的胰胨水中，36 1
15、培养 24 h，观察液体的混浊情况。创伤弧菌在含 0%、8和 10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，胰胨水澄清透亮或稍混浊，而在含 3%、6% 氯化钠的胰胨水中生长旺盛，胰胨水混浊。5.6.1.2 确证实验将初步鉴定为创伤弧菌的疑似菌落接种在 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上，361培养 18 h1 h 后，取纯培养物分别 接种于含 3%氯化钠的赖氨酸脱羧酶试验培养基和MR-VP 培养基中，36 1培养 24 h48 h 后观察结果；另取少许纯培养物接种于 3%氯化钠三糖铁琼脂斜面，361培养 18 h 后用于 ONPG 试验。也可选择生化鉴定试剂盒进行鉴定。创伤弧菌生化特性见表 3，与其他
16、弧菌的鉴别见表 4。表 3 创伤弧菌生化特性试验项目 结果革兰氏染色镜检 阴性，无芽胞氧化酶 动力 D-纤维二糖 蔗糖 葡萄糖 分解葡萄糖产气 乳糖 /硫化氢 赖氨酸脱羧酶 V-P ONPG 注：阳性；阴性。6表 4 创伤弧菌主要生化特性与其他弧菌的比较鉴别嗜盐性试验NaCl 含量（ %）名称氧化酶赖氨酸精氨酸鸟氨酸明胶脲酶V P42蔗糖D纤维二糖乳糖阿拉伯糖D甘露糖D甘露醇ONPG0 3 6 8 10创伤弧菌V. vulnificus V / V 副溶血性弧菌V.parahaemolyticus V V 溶藻弧菌V. alginolyticus 霍乱弧菌V. cholerae V 拟态弧菌V
17、. mimicus 河弧菌V. fluvialis V V 弗氏弧菌V. furnissii 梅氏弧菌V. metschnikovii V V 嗜水气单胞菌A. hydrophilia V V V V V V 类志贺邻单胞菌P. shigelloides 注：表示阳性，表示阴性，V 表示可变75.6.2 PCR 鉴定本部分试验可替代 5.6.1 用于创伤弧菌的快速鉴定。5.6.2.1 DNA 模板的制备从 5.5 中 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落，转至 500 L无菌超纯水中，充分混匀后制成肉眼可见的混浊菌悬液，煮沸 10 min、12 000 r/min 离心 5 m
18、in，取上清液用于 PCR 分析。若不能及时分析则于-20 保存备用。也可以用商业化的 DNA 提取试剂盒按其说明提取制备 DNA 模板。5.6.2.2 PCR 扩增和电泳同 5.3.2 和 5.3.3。5.6.2.3 结果判定质控系统：阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小（519 bp）的扩增条带，则检测系统正常。否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验，同时排除污染因素。阳性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品出现预期大小（519 bp）的扩增条带，判定 PCR 结果为阳性，该菌株是创伤弧菌。阴性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品未出现预期大小（519
19、bp）的扩增条带，判定 PCR 结果为阴性，该菌株不是创伤弧菌。5.7 创伤弧菌分型（选做）5.7.1 DNA 模板的制备取鉴定结果为创伤弧菌的菌株制备 DNA 模板，制备方法同 5.6.2.1。5.7.2 PCR 扩增5.7.2.1 引物PCR 分型用引物信息见表 5.表 5. 创伤弧菌 PCR 分型用引物信息目的基因 引物序列 片段长度 （bp） 备注vcgC F:5 agc tgc cga tag cga tct 3R:5 tga gct aac gcg agt agt gag 3 97vcgE F:5 ctc aga aag gct caa ttg ac 3R:5 gat taa cg
20、c tgt aag gcc g 3 199毒力相关基因vcg 分型16S rRNA A F:5 cat gat agc ttc ggc tca a 3R:5 cac tac cac ctt cct cac gac 3 28516S rRNA B F:5 gcc tac ggg cca aag agg 3R:5 cct gcg tct ccg ctg gct 3 83916S rRNA 基因分型SerE F:5 tgt tgt tcttgc cca ctc tc 3R:5 cgc gct tag att tct ctc acc 3 665Bt2 F:5 aga gat gga aga aac a
21、gg cg 3R:5 gga cag ata taa ggg caa atg g 3 344生物型和血清E 型检测5.7.2.2 对照设置：每次 PCR 反应使用含有目的基因的创伤弧菌标准菌株作为阳性对照，同时，使用除创伤弧菌之外的其他革兰氏阴性菌标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照。5.7.2.3 PCR 反应体系同表 2。85.7.2.4 PCR 反应程序预变性：94、 5 min；变性： 94、1 min，退火：55（vcg 基因）、58（16S rRNA 基因）、64（Bt2 基因及 SerE 基因）1 min，延伸：72、1 min ；循环数：30 个循环（vcg 基因及
22、 16S rRNA 基因），35 个循环（Bt2 基因及 SerE 基因）；终延伸：72，5 min；电泳。若不能及时电泳检测，则将扩增产物于 4储存。5.7.3 电泳同 5.3.3。5.7.4 结果判定质控系统：阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，则检测系统正常。否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验，同时排除污染因素。在质控系统正常的情况下，如果待测菌株出现 97 bp 大小的条带，则判定该株创伤弧菌为 vcg C 型；如果出现 199 bp 大小的条带，则判定该株创伤弧菌为 vcg E 型；如果待测菌株出现 285 bp 大小的条带则判定该株创
23、伤弧菌为 16S rRNA A 型，如果出现 839 bp 大小的条带则判定该株创伤弧菌为 16S rRNA B 型，如果同时出现 285 bp 和 839 bp 两条带，则判定该株创伤弧菌为 16S rRNA A/B 型；如果待测菌株出现 665 bp 大小的条带，则判定该株创伤弧菌为血清 E 型；如果待测菌株出现 344 bp 大小的条带，则判定该株创伤弧菌为生物型。6 结果与报告根据菌落特征、生化特性或 PCR 鉴定结果，报告 25 g 样品中检出或未检出创伤弧菌。9附录 A培养基和试剂A.1 蛋白胨-氯化钠-纤维二糖-多粘菌素 E（PNCC）增菌液A.1.1 溶液 1 A.1.1.1
24、成分蛋白胨 50.0 g氯化钠 10.0 g蒸馏水 900.0 mLpH 8.50.2A.1.1.2 制法将 A.1.1.1 各成分溶于蒸馏水中，用 1 mol/L 盐酸溶液和 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 8.50.2，121高压灭菌 10 min。A.1.2 溶液 2A.1.2.1 成分纤维二糖 0.8 g多黏菌素 E 1 000 U蒸馏水 100.0 mLA.1.2.2 制法将纤维二糖溶于蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加入抗菌素，用 0.22 m微孔滤膜过滤除菌后备用。将溶液 1 与溶液 2 混合即为 PNCC 增菌液。A.2 纤维二糖-多粘菌素 E（CC）琼脂培养基
25、A.2.1 溶液 1A.2.1.1 成分蛋白胨 10.0 g牛肉粉 5.0 g氯化钠 20.0 g溴麝香草酚蓝 0.04 g甲酚红 0.04 g琼脂 15.0 g蒸馏水 900.0 mLpH 7.60.2A.2.1.2 制法将 A.2.1.1 中的各种成分溶于蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后，用 1 mol/L 盐酸溶液和 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.60.2，冷却至 4855 备用。A.2.2 溶液 2A.2.2.1 成分纤维二糖 10.0 g10多黏菌素 E 400 000 U蒸馏水 100.0 mLA.2.2.2 制法将纤维二糖溶于 100.0 mL 蒸馏水中，轻微加热
26、至完全溶解，冷却后加入抗菌素，用0.22 m微孔滤膜过滤除菌后备用。将溶液 2 与溶液 1 混合后倾注平板。A.3 改良纤维二糖-多粘菌素 B-多粘菌素 E（mCPC）琼脂培养基A.3.1 溶液 1A.3.1.1 成分蛋白胨 10.0 g牛肉粉 5.0 g氯化钠 20.0 g溴麝香草酚蓝 0.04 g甲酚红 0.04 g琼脂 15.0 g蒸馏水 900.0 mLpH 7.60.2A.3.1.2 制法将 A.3.1.1 中的各种成分溶于蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后，用 1 mol/L 盐酸溶液和 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.60.2，冷却至 4855 备用。A.3.2 溶液
27、 2A.3.2.1 成分纤维二糖 10.0 g多黏菌素 B 100 000 U多黏菌素 E 400 000 U蒸馏水 100.0 mLA.3.2.2 制法将纤维二糖溶于 100.0 mL 蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加入抗菌素，用0.22 m微孔滤膜过滤除菌后备用。将溶液 2 与溶液 1 混合后倾注平板。A.4 3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂A.4.1 成分胰蛋白胨 15.0 g大豆蛋白胨 5.0 g氯化钠 30.0 g琼脂 15.0 g蒸馏水 1 000.0 mLpH 7.30.2A.4.2 制法11将 A.3.1 中的各种成分溶于蒸馏水中，用 1 mol/L 盐酸溶液和 1 mol/L
28、氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.30.2，121高压灭菌 15 min。A.5 磷酸盐缓冲液（PBS）A.5.1 成分磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0 g蒸馏水 500.0 mLA.5.2 制法贮存液：称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500.0 mL 蒸馏水中，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液（约 175 mL）调节 pH 至 7.2，用蒸馏水稀释至 1 000.0 mL 后于冰箱贮存备用。稀释液：取贮存液 1.25 mL，用蒸馏水稀释至 1 000.0 mL，分装于适宜容器中，121高压灭菌 15 min。A.6 3氯化钠三糖铁琼脂斜面A.6.1 成分蛋白胨 15.0 g胰蛋白胨
29、5.0 g牛肉粉 3.0 g酵母粉 3.0 g氯化钠 30.0 g乳糖 10.0 g蔗糖 10.0 g葡萄糖 1.0 g硫酸亚铁（FeSO 4） 0.2 g酚红 0.024 g硫代硫酸钠（Na 2S2O3） 0.3 g琼脂 12.0 g蒸馏水 1 000.0 mLpH 7.40.2A.6.2 制法将 A.4.1 中的各种成分溶于蒸馏水中，用 1 mol/L 盐酸溶液和 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.40.2。121 高压灭菌 15 min 后分装于试管中，制成斜面长 4 cm 5 cm、深度 2 cm3 cm 的高层斜面备用。A.7 嗜盐性试验培养基12A.7.1 成分胰蛋白
30、胨 10.0 g氯化钠 按浓度不同依次加入相应量蒸馏水 1000.0 mLpH 7.20.2A.7.2 制法将 A.5.1 中的各种成分溶于蒸馏水中，用 1 mol/L 盐酸溶液和 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.20.2 后，分装到 300 mL 三角瓶中，每瓶 100 mL，共配置 5 瓶，分别加入不同量的氯化钠：（1）0 g；（2）3 g；（3）6 g；（4）8g；（5）10 g。继而将各个浓度氯化钠溶液分装至适当容量的试管中，每管 10mL，121 高压灭菌 15 min 备用。A.8 3氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基A.8.1 成分蛋白胨 5.0 g酵母粉 3.0 g葡
31、萄糖 1.0 g溴甲酚紫 0.02 gL-赖氨酸 5.0 g氯化钠 30.0 g蒸馏水 1 000.0 mLpH 6.80.2A.8.2 制法将 A.6.1 中除赖氨酸以外的其他成分溶于蒸馏水中，用 1 mol/L 盐酸溶液和 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 6.80.2，再加入赖氨酸，使其最终浓度达 0.5（对照培养基不加赖氨酸），分装小试管，每管 0.5 mL，121 高压灭菌 15 min。A.9 3氯化钠 MR-VP 培养基A.9.1 成分多价蛋白胨 7.0 g葡萄糖 5.0 g磷酸氢二钾（K 2HPO4） 5.0 g氯化钠 30.0 g蒸馏水 1 000.0 mL13pH
32、 6.90.2A.9.2 制法将 A.7.1 中的各种成分溶于蒸馏水中，用 1 mol/L 盐酸溶液和 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 6.90.2，分装试管，121 高压灭菌 15 min。A.10 3氯化钠溶液A.10.1 成分氯化钠 30.0 g蒸馏水 1 000.0 mLpH 7.20.2A.10.2 制法将上述氯化钠溶于蒸馏水中，121高压灭菌 15 min。A.11 氧化酶试剂A.11.1 成分N,N,N,N-四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0 g蒸馏水 100.0 mLA.11.2 制法氧化酶试剂应少量配制，配置后于 2 5 冰箱内避光保存，并在 7 d 之内使用完毕。A.12
33、 革兰氏染色液A.12.1 结晶紫染色液A.12.1.1 成分结晶紫 1.0 g95%乙醇 20.0 mL1%草酸铵水溶液 80.0 mLA.12.1.2 制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.12.2 革兰氏碘液A.12.2.1 成分碘 1.0 g碘化钾 2.0 g蒸馏水 300.0 mLA.12.2.2 制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300.0 mL。14A.12.3 沙黄复染液A.12.3.1 成分沙黄 0.25 g95乙醇 10.0 mL蒸馏水 90.0 mLA.12.3.2 制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A
34、.12.4 染色法A.12.4.1 将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1 min，水洗。A.12.4.2 滴加革兰氏碘液，作用 1 min，水洗。A.12.4.3 滴加 95%乙醇脱色，约 15 s30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.12.4.4 滴加复染液，复染 1 min。水洗、待干、镜检。A.13 邻硝基酚-D-半乳糖苷（ONPG）试剂A.13.1 成分邻硝基酚-D-半乳糖苷（ONPG） 0.08 g蒸馏水 15.0 mL缓冲液 5.0 mLA.13.2 制法将 ONPG 在 361的蒸馏水中充分溶解后，加入缓冲液，混匀后置 25冰箱保存，试验前，将所需用量的 ONPG 溶液加热至 361后使用。A.14 Voges-Proskauer（V-P）试剂A.14.1 成分甲液-萘酚 5.0 g无水乙醇 100.0 mL乙液氢氧化钾 40.0 g蒸馏水 100.0 mLA.14.2 制法甲液：将 5.0 g -萘酚于 100.0 mL 无水乙醇中溶解。乙液：将 40.0 g 氢氧化钾于适量蒸馏水中充分溶解后定容至 100.0 mL。将制备的甲液和乙液分别保存于 25 冰箱。
