1、超高倍显微镜系统支原体活体镜验法与培养法实验结果比较医学检验与临床 2010 年第 2】卷第 5 期MedicalLaboratoD,ScienceandClinic!120!N0.doi:10.3969/j.issn.16735013.2010.05.016超高倍显微镜系统支原体活体镜验法与培养法实验结果比较赵莉徐万菊张忠房(山东省千佛山医院检验科,山东济南)【摘要】目的建立超高倍显微镜分析系统在动态,活体观察性传播性疾病的主要病原体一支原体的实验方法,探讨其临床应用价值.方法应用超高倍显微镜分析系统直接镜检动态观察支原体并与培养法对照.结果超高倍显锨镜分析统可以清晰的观察支原体.镜捡法与培
2、养法结果高度一致.结论镜检法采取直接取样涂片,无需染色,可快速,绝确的咒雾支原体,做出正确诊断,该方法的建立及使用可为临床试验室病原体检测提供一个全新的检测技术,展示有广阔的应用前景.【关键词】超高倍显微镜系统;支原体;镜捡法;培养活TheultrahighpowermicroscopesystemmycoplasmalivingbodymicroscopicexaminationmethodandctflturemethodexperimentresultcomparisonZhax,Li,XIlWanju,ZhangZhongfang(ClinicallaboratoryofQianfos
3、hanhospiofShahdongprovince,Jinan,).【AbstractObjeiveToestablishobservingmainpathogenofsexuallytransmitteddiseasesmyeoplasmaexperimentmethodindynamicandlivebodyconditionbyultrahishpowermicroscopeanalysissystem,anddiscussitcliainal印 plicationvalue.MethodsUsingultrahighpowermicroscopeanalysissystemdirec
4、tlymicroscopicexaminationobservemyeoplnsmaindynanficconditioneandeomparedwithcIllIllremerited.ResultsUltrahighpowermicroscopeanalysissystemCanclearlyobservemycoplasma,theresultsofmicroscopicexaminationmethodandculturemethodafeveryconsistent.ConclusionMicroscopicexaminationmethodadoptdirectnesssampli
5、ngsmear,notusedyeing,carlquicklyandcorrectlyobservemycophsnm,docorrectdiagnosis,thismethodSestablishmentandusemayprovideabrandnewdetecfiortechnologyfortheclinicallaboratoD,pathogenexamination,demonstratedthathasbroadapplicationprospect.【KeywordsUltrahighpowermicroscopesystem;Myeoplasma;Microscopicex
6、aminationmethod;Culturemethod2005 年我们开展了超高倍显微镜分析系统在性传播性疾病(STD)中的应用,对 STD 中的解脲支原体和人型支原体形态的确认进行了大量的工作,解脲支原体(Uu) 和人型支原体 (Mh)采用多个血清型号的国际标准株进行液体和固体培养,观察其形态特点,确认了其形态特征并运用于临床四年,共检查了 6000 多人次的病人标本,积累了大量的临床资料,认为多媒体纤维成像分析系统在性传播性疾病(STD)中具有极强的应用价值,尤其是在支原体的诊断方面具有快速,准确的特性.该方法的合理使用可为临床实验室提供一个全新的检测技术.1 材料与方法1.1 临床资
7、料 2005 年开始我们利用多媒体显微系统观察研究各类分泌物标本中的支原体的形态特征,2009 年 5 月,我们进行了大量的解脲支原体的培养法与镜检法的对照工作,病人来源于我院泌尿外科,皮肤科,妇产科就诊的患者,共 129 例,年龄 l462 岁,平均年龄 31 岁.采用随机双盲的方法,同时采样,一份送解脲支原体培养,一份送超高倍显微镜分析系统镜检.1.2 取样方法1.2.1 前列腺液:男性患者排空尿液.言肛.1前列腺按摩,自尿道口收集前列腺液.取 3 漓于消毒脱脂玻片上,加盖片立即送检.同时取 35 潭手无菌管内送解脲支原体培养.1.2.2 男性分泌物:消毒尿道口,用男性拭亏二插尿道 23c
8、m.用力旋转.停留 3O 秒,取出拭子连培养.同样方法取一份标本送镜检1.2.3 精液:常规取精液的方法,一份直接取在无菌管中送培养,一份将精液滴于消毒脱脂瑷土.可盖片立即送镜检.I.2.4 宫颈分泌物:用无菌棉拭子擦 i 净言颈三再用无菌棉拭子插入宫颈口 34cm,用力旋转.停留 30 秒,取出试子,一份送培养,同样方法一兰镜检.46MedicalLaboratoryScienceandC2finics.2010,Vo121,No.5 医学检验与床 2010 年簧 2i 卷第 5 期1.2.5 阴道分泌物:用无菌棉拭子取阴道后穹隆分泌物,一份送培养,同样方法取一份送镜检.1.3 仪器与观察方
9、法.采用超高倍显微镜分析系统,型号:ACT2000,上海复兴实业有限公司生产;型号 DZ510,上海大众世纪数字分析系统有限公司.仪器的共同特征为共轭变焦,清晰度高,放大倍率可达 15000 倍,分辨率为 0.3 微米.将标本置显微镜下,采用相差视野和暗视野直接活动镜检,根据观察需要可选用其它不同视野镜检,同时报告检测标本的常规检验数据.1.3.1 解脲支原体和人型支原体的确认:国际标准株解脲支原体纯菌种,人型支原体纯菌种液体培养基和固体培养基均由全国性病监控中心,中国医学学院皮肤病研究所提供.液体和固体的培养严格按照操作说明书,液体培养基出现阳性后,离 t5 沉淀,取沉淀物观察其形态特征;固
10、体培养基出现阳性(支原体的菌落,形似油煎荷包蛋),将菌落挑出放在载玻片上,用酒精灯轻烤载玻片,使菌落部位的琼脂融化,使菌落黏附在玻片上,无需染色,(须保证菌落是活体)应用超高倍显微镜系统,再放大倍率为7000 倍视野下观察其形态特征.支原体大小一般在 0.30.5urn 之间,没有细胞壁,呈高度多形性,有球形,杆形,丝状,分枝状等多种形态.解脲支原体和人型支原体形态清楚可见,但仅从形态上很难区别解脲和人型支原体,也不能进行血清学分型.菌落 Dienes 染色为蓝色,草兰氏染色为阴性 ,但不易着色.很容易与细菌和真菌的区别,因为支原体没有细胞壁,但须与细菌一 L 型鉴别,细菌一 L 型菌落Die
11、nes 染色后不显色,油煎荷包蛋样的菌落转种于无青霉素的培养基中,将长出有细胞壁的细菌的菌落,而支原体仍长出油煎荷包蛋样的菌落 2j.1.3.2 诊断标准:参考曹兴午拟定标准2 结果2.1 培养结果观察液体培养基由红色变为玫瑰红色,清晰透明为阳性.无变色为阴性.2.2 镜检与培养结果及统计学处理结果见附表.表 1 镜检结果与培养结果对照表【男,女)表 2 男性标本镜捡结果与培养结果对照表表 3 女性标本镜检结果与培养结果对照衰镜检结果阳性阴性合计 31t卡方检验培养结果阳性阴性P 值0.05台订3211375表 5 男性标本镜检与培养结粜统计比较表 6 女性标本镜检与培养结果统计比较3 讨论支
12、原体活体镜检和培养两种方法的检测结果总符合率高达 83.02%,不符合率仅为 16.98%,经配对计数资料卡方检验,按 1696 例标本计,P 值0.05,两种方法尚存有显着差异,其镜检方法阳性率略高于培养法;但以女性 919 例标本计算,P 值0.05,两种方法间无明显差异;而男性 777 例标本的 P值0.01,显示两种方法的差异主要来源于男性标本其镜检阳性率高于培养法的原因可能百:病人在药物治疗中,药物抑制支原体生长造成假阴性,而镜下仍可见支原体残体.我们使用的仅为解尿支原体培养基培养,表用人型支原体培养基培养,亦是造成假阴性的直接原因.因为泌尿生殖道感染除解脲支原体以外,尚有人型支原体
13、和生殖支原体引起的感染在形态学二很难区别支原体的类型.培养标本量太少,浓度不够,造成假阴性细菌 L 一型在失去细胞壁后有许多特性与原体极为相似,仅从形态上鉴别两者很困难.超高倍显微镜系统对未染色的标本在研究支原体方面具有非常积极的作用.暗视野显做镜胃浮在液体培养基中的支原体的形态学特征是极为有交三医学检验与临床 2010 年第 2l 卷第 5 期 MedieLaboratoD-ScienceandCfiaics,2010.Vo121,No.547?的方法.由于支原体缺乏细胞壁,当用常规的细菌固定与染色方法观察支原体时,支原体的细胞形态受到了很大的损害.观察支原体形态,应选择固体培养基表面生长的
14、活的支原体.例如,在琼脂表面支原体菌落或者液相培养基中吸附在玻璃表面的生长细胞.由于固体培养基上支原体形态受到琼脂一空气界面作用力的影响,所以液相培养基中支原体为支原体形态学的研究提供了最好的方法,特别是连续观察生长过程,因为细小的支原体细胞受到布朗运动的影响而快速移动,仅仅只有吸附在玻璃表面的支原体细胞才适合观察.支原体生长随生长周期不同而形态有变化,支原体在液体培养基中生长繁殖具有细菌在液体培养基中生长相似的规律性,一般也经迟缓期,对数期,稳定期和衰退期各期中支原体形态特点有所不同.在迟缓期中.支原体平均数并不增加,但个体增大,染色性强对数期支原体形态,大小和染色性均较典型,呈杆状及双极形
15、态.稳定期或衰退早期支原体形态发生变化,并有许多空泡.?文献报道 3j 支原体可进入细胞致病,精液中.脱落的生精细胞内有 UU 就侵入生精细胞,并造成后者结构破坏,与畸形精子的产生有关.Audfing 用uu 人工感染大鼠,3 周后睾丸精原细胞内可见许多uu 样结构.过去认为支原体是表面寄生菌,不侵入组织及细胞内,但可从自细胞表面嵌入 L2j.自 LO报道 AIDS 患者组织及细胞内见到发酵支原体后,一些学者用金标记抗血清及钌红(ruthenium) 作用后,见支原体在细胞内,未被染红的细胞膜包绕,而嵌入细胞的支原体,可见到周围有红染的细胞膜.发酵支原体,梨支原体,穿透支原体,人型支原体,生殖
16、支原体,解脲脲原体,精氨酸支原体,肺炎支原体均在细胞浆内见到.在我们的研究中发现在培养的标本中,可见支原体进入上皮细胞的核和细胞浆中繁殖,很活跃,也可被自细胞吞噬,在白细胞浆中繁殖.当细胞内的支原体繁殖到一定的程度时,细胞将破裂,305 个成群的支原体被细胞膜包围,也可单个的多形态的支原体存在 l-6 一.由此说明支原体并不是表面寄生菌.它即可以进入细胞内致病,也可嵌入细胞内.支原体须与 L 一细菌的鉴别:细菌 L 一是细菌在一些能影响其细胞壁合成的抗生素和溶菌酶及许多环境因素的作用下形成的一种细胞壁缺陷性微生物.细菌 L 一型在失去细胞壁后有许多特性与支原体极为相似,如变为多形性,在固体培养
17、基上也呈荷包蛋样,但把它们煎蛋样菌落转种于无青霉素的培养基中,如果原始菌落是支原体,仍长出煎蛋样苣落.如果原始菌落是 L 一型,在无青霉素的情况下将恢复细菌原形态,并将产生有细胞壁的细菌的典型表面菌落 uj.多媒体显微镜成像分析系统临床应用的优点:方便,快捷,镜验仅需 10 分钟.一澎片,昱 E可观察到细菌,真菌,滴虫,支原体,衣原 fZ=,球墓,纤毛菌,线索细胞等病原体,多数情况下乏需染色彭可观察,如有细菌感染,须作革兰氏染色以另 j 是革兰氏阴性菌,是球菌还是杆菌,指导临屎医生迄簿恰当的培养基和药敏试验,指导临床医生 l 用药.监控治疗过程,超高倍显微镜分析系统栗 f=_多媒体计算机技术,
18、配有大屏幕显示,县有实时图像捕获,测量,标实,动静态存储,回放,歪询,检累,印等功能,病人图片存取方便.使用领域广泛,如镜检分泌物,脱落细胞,寄生虫与原虫,尿沉渣,血液与骨髓细胞,微生物形态学,病理学等研究.临床检验专业学生形态学教学.加荧光装置,可以一机多用,开展荧光免疫技术.超高倍显微镜分析系统临床应用不足之处;C不能确定细菌的具体名称和提供药敏不是支原阵和衣原体诊断的金标准病原体太少,镜检易漏诊对操作者的临床经验和临床知识要求更高.从我们的试验结果可以看出,多媒体显微分析系统用于性传播性疾病病原体一支原体的诊断,具有方便,快捷,准确,该仪器为临床实验室提供一个全新的检测技术,使用领域广泛
19、,如镜检分泌物,脱落细胞,寄生虫与原虫,尿沉渣,血液与骨髓细胞,微生物形态学研究等,待开发的应用领域还很多.舀前在使用过程中,还存在一些问题,如:应规范化操作,严格和统一诊断标准,才是有很好的应用与开发前景.参考文献】叶顺章 .张木有.现代性传播疾病实验诊断技术.笋一版.一: 一东科技出版社.1997.3638.2曹玉璞,叶元康 ,支原体与支原体病人民卫生出版荭.2(kq6.53曹兴午,生殖系统支原体感染的研究,脲原体感染桩子的相巷鬣像观察.性学 1994:3(4):274曹兴午,生殖系统支原体感染的研究,脲原体感染富聂缎脆,戈镜,电镜的观察,性学,1995.4(3】:435j“uanpuHaoYiniie.eta1.EffectofSpermlcide8l 一ttmls【兀:.tureofHumanSpermatozoainVitro.JMedCoilPAL.1990.3(一.jj6覃西,钱士匀 .新编临床检验图谱.海口:海南出版桎.2001l.一
