1、三维多孔支架孔径调节人间充质干细胞成骨分化的研究#叶朝阳，谭可*510152025303540（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）摘要：本研究为探究多孔支架孔径对干细胞成骨分化行为的影响，首先通过制备不同粒径的明胶微球，以此为致孔剂来制备孔径大小可调的聚己内酯三维多孔支架；进而以人间充质干细胞为研究对象，考察其培养 14d 后的成骨分化效果。基于扫描电镜表征发现，聚己内酯多孔支架能够很好的复制致孔剂的尺寸和形态，且按孔径大小分为四类，分别具有 100-200 m，200-300 m，300-450 m 和 450-600 m 的孔径。在成骨诱导培养后，通过扫描电镜、
2、茜素红和 ALP 染色、钙含量和 ALP 酶活性检测、基因表达分析，发现孔径为 200-300 m 的支架最有利于人间充质干细胞的成骨分化，孔径越大，成骨分化效果越差。该结果为骨组织工程支架材料的构建提供了基础数据。关键词：组织工程；多孔支架；孔径；间充质干细胞；成骨分化中图分类号：请查阅中国图书馆分类法Effects of Pore Size of Three Dimensional Porous Scaffoldson Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal StemCellsYE Zhaoyang, TAN Ke(State Key
3、 Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science andTechnology, Shanghai 200237)Abstract: The objective of this paper was to study the effects of pore size of three dimensionalporous scaffolds on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. In order to fabricatepo
4、rous polycaprolactone scaffolds, gelatin microspheres with different diameters were firstprepared, which were used as porogen. Based on scanning electron microscopy (SEM), scaffoldswere able to replicate the size and morphology of the porogen, resulting in four types of scaffoldswith different pore
5、size: 100-200 m，200-300 m，300-450 m and 450-600 m. After 14d osteogenic induction, based on SEM, Alizarin red S staining, ALP staining, calciumquantification, ALP activity assay, and gene expression analysis, it was found that humanmesenchymal stem cells demonstrated highest osteogenic differentiati
6、on in scaffolds with 200-300m. These data definitely provide guidance for fabricationg bone tissue engineering scaffolds.Key words: tissue engineering; porous scaffolds; pore size; mesenchymal stem cells; osteogenicdifferentiation0 引言生物支架材料需要模拟天然胞外基质，为细胞和再生组织提供一个暂时的结构支持，同时也能传导必要的生物物理、生物力学和生物化学的指令来调节
7、细胞的粘附、增殖和分化以及组织结构的形成1。支架的材料类型、几何形态、力学特性、化学及生物物理因素和一些可溶性因子能影响细胞的铺展形态和面积以及细胞间的接触，进一步对细胞的生长、迁移、增殖和分化起到重要的调节作用2-4。孔径是三维多孔支架物理结构的重要参数，它除了能决定支架内部的物质交换，还能影基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(20100074120009)作者简介：叶朝阳（1977-），男，副教授，主要研究方向：组织工程. E-mail: -1-响细胞铺展过程中的骨架张力，进而调节细胞的行为。在生物支架材料上，细胞能识别小到4550555 nm 的微结构，而如果孔径远远大于细胞的直径
8、，细胞会将孔表面识别成一个平面或是一个微弧度的表面5。一般来说，小孔径的支架可能有利于细胞的初期粘附，大孔径的支架能促进细胞往支架内部迁移。在体内，干细胞所处微环境的空间结构也能影响其分裂行为6。文献已经报道了大量关于孔径影响细胞成骨分化的研究，普遍认为 100-450 m 的孔径有利于骨组织的形成，但是不同的细胞可能会存在特定的最适孔径。比如，孔径为 100-300 m的支架有利于骨髓来源间充质干细胞的成骨分化 7；孔径为 200 m 的支架有利于hMSC-TERT4 细胞向成骨分化8；有研究发现孔径为 350 m 的支架最有利于成骨细胞增殖，而孔径为 500 m 的支架由于孔径过大导致细胞
9、的粘附效率低而不利于细胞增殖9。目前，对于三维多孔支架的孔径对干细胞的生长和分化以及组织的形成方面的影响有了一定的研究，但是认识还很肤浅，依然有待系统深入的研究。本研究首先利用生物相容性和生物降解性好的聚己内酯，以具有不同粒径的明胶微球为致孔剂，通过热致相分离和粒子浸出相结合的方法制备出不同孔径范围内的三维多孔支架；进而通过将人间充质干细胞接种在不同孔径的支架上，来考察三维多孔支架的孔径对间充质干细胞成骨分化的影响。1 材料与方法601.1 明胶微球的制备将明胶（Gelatin 9382, Sigma）以 24-40%的浓度（W/V）加入三蒸水中，在 60左右让其融化；然后，将液体石蜡（VPa
10、raffin /VGelatin=5:1）倒入到圆底烧瓶中，将其预热到 40（10min 左右），转速控制在 300 rpm；将明胶溶液逐滴加入到正在搅拌的液体石蜡中，让其均匀分散在液体石蜡中，搅拌 30 min 左右后，将加热装置去除，并换上冰浴，让其迅速冷却，使分散在液体石蜡中的明胶微球快速固化，继续搅拌 30 min 后，再向烧瓶中倒入预冷至-2065 的丙酮（VAcetone/VParaffin=3:10），且继续搅拌 1 h；最后，停止搅拌，待烧瓶中的微球均沉降到底部后，倒去烧瓶中的上液，再用丙酮和乙醇冲洗微球数遍，用来去除明胶微球表面粘附的液体石蜡和置换出微球中残留的水分子，将处理
11、好的微球用水泵干燥。为了得到不同粒径范围分布的明胶微球，将其用标准分样筛进行筛分，得到粒径分布在 100-200 m、200-300m、300-450 m 和 450-600 m 区间范围内的明胶微球，储存在干燥器中备用。70 1.2 三维多孔支架的制备将 PCL（Sigma）以 17%（W/V）的比例溶解在 1,4-二氧六环中，将筛好的明胶微球按一定的比例（WPCL:W Gelatin=1:7）加入到其中并充分混合均匀，浇铸至具有圆柱形腔体的聚四氟乙烯模具中，置于-20热致相分离 57 h 后取出，脱模后将支架置于预冷至-20 的乙醇中浸泡 24 h，以置换出支架中的 1,4-二氧六环溶剂，
12、再将其在室温下自然挥发 6 h 后，置75 于去离子水中 3 d，用粒子浸出的方法将支架中的明胶微球溶出，每天换水 2-3 次，最后将支架晾干，就形成了三维多孔支架。1.3 细胞培养实验人间充质干细胞按照我们实验室先前报道的方法从人羊膜组织分离、培养及传代 10。在细胞实验之前，必须将支架做无菌处理后再进行细胞接种。首先，将干燥的支架制成尺寸80 为 5 mm 5 mm 2 mm 的长方体小块，再将支架小块的上下表面紫外各照射至少 30 min，对支架的表面进行初步杀菌；在超净工作台中将支架样本放入 24 孔板（一个样/孔）中，让-2-其在 75%的酒精中处理 2 次，每次 1 h，对支架的表
13、面和内部进一步除菌，之后再用 1PBS置换出支架孔内的酒精；最后，将除菌后的支架置于含 10% FBS 的 -MEM 生长培养基中，并将其置于 5% CO2、37饱和湿度培养箱中孵育 12 h。将第 5 代的人间充质干细胞以 50 L8590按 4104 cells/scaffold 的细胞浓缩液逐滴滴入放在 24 孔板内的不同孔径的支架小块表面用于成骨诱导实验。待细胞在支架上均粘附 3 h 后，用镊子将支架小块转移到另一个加有生长培养基的孔板中，将其置于 5% CO2、37饱和湿度培养箱中培养过夜，第二天将生长培养基换成诱导培养基，每隔 2 d 换液。成骨诱导培养基的组成如下：DMEM（Gi
14、bco）中加入 10%FBS、100 U/mL 青霉素/链霉素、 2 mol/L 地塞米松（Sigma）、0.05 mg/mL 抗坏血酸（Sigma）、10 mmol/L -甘油磷酸（Sigma ）。1.4 扫描电镜对于明胶微球表面形态的观察，将干燥的明胶微球均匀的分散在粘有导电胶的铝座上，喷金后进行扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM，JSM-6360LV ，JEOL ）观察。对于支架内部结构和孔径的观察，先将大块的支架经液氮处理后进行脆断，把块状断物置于粘95 有导电胶的铝座上，脆断面朝上进行喷金后，进行 SEM 观察。取培养至一定天数的不同孔径支架/
15、细胞样品，经 1PBS 润洗 1 遍，样品用 2.5%戊二醛溶液（ pH 7.4）4固定过夜后酒精梯度脱水，把干燥的支架/细胞样品粘于有导电胶的铝座上，细胞接种面朝上喷金后，进行 SEM 观察。1001.5 茜素红染色在成骨诱导 14 d 后，取不同孔径的细胞/支架样品用 1PBS 润洗 1 遍，再用 95%乙醇固定细胞 15 min，待样品用 1%茜素红染液（Sigma）室温孵育 20 min 后，观察胞外钙沉积和矿化结节情况。1.6 钙含量的测定在成骨诱导 14 d 后，取不同孔径的支架/细胞样品用 1PBS 润洗 1 遍，将样品分别置于105 EP 管中，分别加入 200 L 的 0.1
16、 M 盐酸溶液，稍震荡后放入 -20储存。待测定时取出 EP管解冻，在漩涡混合器上充分振荡混匀，1000 rpm 离心 5 min，取上清液用钙测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定钙离子浓度，每个样品设 3 组平行样。1.7 NBT 染色在成骨诱导 14 d 后，取不同孔径的支架/细胞样品经 1PBS 润洗 1 遍，用 4%多聚甲醛110 固定细胞 15 min 后，将样品置于 BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐）/NBT（四氮唑兰）染液（碧云天生物技术研究所）中室温避光孵育 30 min，去除 BCIP/NBT 染液后用蒸馏水润洗样品 2 次终止显色反应，观察细胞表达的 ALP 活
17、性。1.8 ALP 活性测定在成骨诱导 14 d 后，取不同孔径的支架/细胞样品用 1PBS 润洗 1 遍，将样品分别置于115 EP 管中，每管加入 200 L 0.2% Triton X-100，稍震荡后放入-20储存。待测定时取出 EP管解冻，在漩涡混合器上充分振荡混匀，1000 rpm 离心 5 min，取上清液用碱性磷酸酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定细胞 ALP 活性，每个样品设 3 组平行样。-3-1.9 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）在细胞培养结束后，取不同孔径的支架/细胞样品（3 个支架/ 样）放入 EP 管中，用 PBS120125130润洗 1 遍，每管
18、加入 200 L Trizol（天根生化科技有限公司），-80 保存。样品从-80中取出，待室温解冻 5 min 后，每 EP 管中加入 100 L 氯仿，震动 15 s 后，室温放置 23 min至分层，28，11240 r/min 离心 15 min；离心后将上层的上清液吸至另一 EP 管中（勿吸中间蛋白层），加入 100 L 异丙醇，混匀后室温静置 10 min，28，11240 r/min 离心 10 min；弃上清，加入 75%乙醇洗涤沉淀，28，8890 r/min 离心 10 min；移去上清后，倒置 EP管晾干沉淀 ；每 EP 管加入 20 L DEPC 水和 0.2 L RN
19、A Inhibitor 的混合液，待沉淀溶解后得到 RNA 样品。取 2 g RNA 样品按照逆转录试剂盒（TaKaRa）进行逆转录，制备 cDNA。按表 3.1 建立 20 L PCR 体系，引物序列见表 3.2，使用 PCR 仪进行聚合酶链式反应。取 4 LPCR 产物，在 2%琼脂糖（天根生化有限公司）凝胶中，120 V 恒压下置于 1TAE 缓冲液（40mmol/L Tris-乙酸盐，1 mmol/L EDTA）中电泳 30 min，电泳结束后，在紫外光下成像拍照。1.10 统计学分析使用 Students T-test 进行统计学分析，p0.05 为统计学上有显著性差异。2 结果与讨
20、论2.1 具有不同孔径的聚己内酯三维多孔支架的制备与表征135 图 1 扫描电镜表征明胶微球和多孔支架25 倍和 150 倍放大倍数下的标尺分别为 1 mm 和 100 m。Fig. 1 SEM characterization of gelatin microspheres and porous scaffoldsScale bars are 1 mm and 100 m at 25x and 150x magnifications, respectively.-4-本研究中，我们以明胶微球作为致孔剂来制备多孔支架。我们发现，明胶溶液的浓度对140145150155微球尺寸的分布十分重要，当
21、明胶溶液的浓度为 24%时，孔径分布在 100-200 m 的微球最多；当明胶溶液的浓度为 30%时，孔径分布在 300-450 m 的微球最多；当明胶溶液的浓度为 40%时，孔径分布在 450-600 m 的微球最多（数据未给出）。因此，在其它条件一致的情况下，明胶微球的粒径会随着明胶溶液浓度的增加而不断增大，可以根据实验所需微球的大小来选择明胶浓度。从 SEM 图（图 1）可以看出，本研究中所制作的明胶颗粒呈球形，且粒径主要分布在 100-600m 之间，不同粒径区间的微球尺寸相对均一。但从放大 150的图可以看出，有些微球的表面形态不是很规整的球形，这可能是由于干燥时微球表面的水分蒸发不
22、一致所致。有研究表明，微球经不同比例的丙酮/水处理后，会导致微球表面的形态发生变化11。因此，通过本实验方法可以制作出粒径可控的明胶微球。从图 1 可以看出，基于明胶微球为致孔剂所制备的聚己内酯多孔支架内部的孔形态基本呈圆形，能够很好的复制明胶微球粒子的形状及大小。此外，通过粒子浸出和热致相分离相结合的方法，所得支架内部孔结构内壁存在很多小孔，这样保证了支架中孔与孔之间的连通性，从而利于细胞在支架中的生长和迁移，以及营养物质的运输和代谢废物的排出。总的来说，基于本实验方法可以制备出孔径可控且孔形态良好的三维多孔支架。基于支架孔径对致孔剂尺寸的复制，我们将支架依据孔径的大小分为四类：100-20
23、0 m，200-300 m，300-450m 和 450-600 m。2.2 三维多孔支架孔径对人间充质干细胞成骨分化的影响本研究中，基于上述所制备的四种具有不同孔径的多孔支架，以人间充质干细胞为对象，我们进一步考察了三维多孔支架孔径对于间充质干细胞成骨分化的影响规律。从成骨诱导14 d 后的 SEM 图（图 2）可以看出，在成骨诱导培养条件下，人间充质干细胞在四种孔径160 的支架上均有钙结节的形成。矿化结节的形成是成骨分化后期的主要标志，这说明人间充质干细胞在四种支架上均发生了成骨分化12。相比之下，细胞在孔径为 200-300 m 的支架上所产生的钙结节较多且结块较大。因此，可以初步认为
24、，孔径为 200-300 m 支架更有利于hAMSCs 的成骨分化。165 图 2 扫描电镜表征间充质干细胞成骨分化25 倍和 5000 倍放大倍数下的标尺分别为 1 mm 和 5 m。Fig. 2 SEM characterization of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cellsScale bars are 1 mm and 5 m at 25x and 5000x magnifications, respectively.170 茜素红染色是最常用的钙结节染色方法，茜素红中羟基、羰基和醌环上三个 C 原子所构
25、成的络合基团，能与钙离子发生反应，生成稳定的五元螯合环配位络合物，并呈现出鲜艳-5-Ca2+/DNA(mmol*10-6/g)坚固的红色13。该染色法能较好地显示钙结节的形成，而钙结节的形成又代表了成骨细胞增殖成熟且具有行使成骨的功能。如图 3 所示，在成骨诱导条件下，所有三维多孔支架都呈现阳性染色响。当然，由于支架对茜素红染料可能存在一定的截留，所以仅从茜素红的染色175180结果很难确定哪种孔径的支架更有利于成骨分化。而直接对钙离子进一步的定量分析结果可以看出，人间充质干细胞在孔径为 200-300 m 的三维多孔支架中单位干重所含钙离子量显著高于孔径较大的支架，其次是孔径为 100-20
26、0 m 的支架（图 3）。Pamula 等人报道孔径为 600 m 的多孔支架比孔径为 200 m 的更有利于人成骨细胞 MG 63 的成骨分化14。而本实验发现孔径较小（100-300 m）的三维多孔支架更有利于间充质干细胞的成骨分化，孔径过大的支架则不利于其成骨分化的，这可能是有不同的细胞会呈现对不同孔径的依赖性。100-200 m 200-300 m 300-450 m 450-600 m1800150012009006003000* *100-200 m 200-300 m 300-450 m 450-600 mScaffolds with different pore sizes图
27、3 茜素红染色和钙含量检测* 表示与孔径为 200-300 m 的支架相比有显著性差异。Fig. 3 Alizarin red S staining and calcium content185190* denotes statistical significance over scaffolds with pore size of 200-300 m.ALP 的活性及表达是成骨分化的一个早期标志，出现在成骨基质矿化之前15。从 NBT定性染色和 ALP 酶活性定量检测结果可知（图 4），人间充质干细胞在四种孔径的支架上成骨诱导 14 d 后，表达一定量的 ALP 酶活性。在孔径为 200-3
28、00 m 的三维多孔支架中单位干重上形成的 ALP 酶活最高，说明孔径为 200-300 m 的三维多孔支架所提供的微环境最适合人间充质干细胞成骨分化，其次是孔径为 100-200 m 的支架，这个与茜素红和钙含量检测结果（图 3）相一致。干细胞向骨组织分化的过程中，基质初步钙化时 ALP 活性较高，在钙化过程接近结束时活性降低15。这可能是本实验中所检测到的 ALP 活性较低的原因。进而，我们表征了成骨分化相关基因的表达水平。-catenin、Runx-2 是成骨分化前期表-6-ALP/DNA(U*10-3/g)达的基因。Runx-2 是间充质干细胞向成骨细胞分化过程中必需的转录因子，其能促
29、进骨胞195200205外基质中蛋白基因的转录和表达。-catenin 表达一种多功能蛋白质，激活与成骨分化相关的靶基因 Runx-2 的转录。由图 5 可见，在成骨诱导培养基中培养 14 d 后，间充质干细胞在四种孔径的支架上的 -catenin 和 Runx-2 基因均有所表达，而在孔径为 100-200 m 的三维多孔支架上的基因表达水平更高，其次为孔径为 200-300 m。ALP 与 Col1age I 为成骨分化中期表达的基因。ALP 催化磷酸基团的转移反应，加速钙盐沉积，从而促进胞外基质矿化。在四种孔径的支架上的 ALP 基因均无明显表达，这可能是由于支架上的细胞已经处于成骨分化
30、后期所致。I 型胶原是成骨胞外基质中最主要的有机组分之一，构成了骨组织的蛋白框架，为钙盐沉积的场所。在孔径为 200-300 m 的三维多孔支架上的基因表达水平显著高于其它孔径的支架，孔径越大，基因表达水平越低。OCN 是成骨分化后期表达的基因，能促进矿化结节的形成，是成骨分化末期重要的标志16。在四种孔径的支架上的 OCN 基因均有所表达，而在孔径为 100-200 m 的三维多孔支架上的 OCN 基因表达水平最高，其次为孔径为200-300 m、300-450 m 和 450-600 m 的支架。100-200 m 200-300 m 300-450 m 450-600 m21.510.5
31、0*100-200 m 200-300 m 300-450 m 450-600 mScaffolds with different pore sizes图 4 NBT 染色和碱性磷酸酶活性检测* 表示与孔径为 200-300 m 的支架相比有显著性差异。210 Fig. 4 NBT staining and ALP activity assay* denotes statistical significance over scaffolds with pore size of 200-300 m.因此，无论是从组织学染色的定性分析和钙离子、ALP 含量的定量分析，还是从基因表达水平的分析，所得
32、到的实验结果是相一致的。小孔径（100-300 m）的三维多孔支架更利于 hAMSCs 的成骨分化，孔径越大的支架对 hAMSCs 成骨分化越不利。这与 Zhang 等人215 所发现的结论是相一致的：孔径为 100-300 m 的支架有利于间充质干细胞的成骨分化7。-7-GAPDH-CateninRunx2ALPCollagen IOCN图 5 成骨基因表达分析3 结论Fig. 5 Osteogenic gene expression analysis220225230235240245250本文基于所制备的具有不同孔径的三维多孔支架，考察了人间充质干细胞的成骨分化随孔径变化的规律，发现在
33、100-600 m 孔径范围内，孔径较小的支架有利于间充质干细胞的成骨分化，这为指导骨组织工程支架的构建提供了基础数据。参考文献 (References)1 HUTMACHER D W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage J. Biomaterials, 2000, 21(24):529-543.2 YAO X, PENG R, DING J. Effects of aspect ratios of stem cells on lineage commitments with and withoutinduction medi
34、a J. Biomaterials, 2013, 34(4): 930-939.3 LIVECCHI A B, TOMBES R M, LABERGE M. In vitro chondrocyte collagen deposition within porousHDPE: substrate microstructure and wettability effects J. J Biomed Mater Res, 1994, 28(8): 839-850.4 SCHWARTZ Z, MARTIN J Y, DEAN D D, SIMPSON J, COCHRAN D L, BOYAN B
35、D. Effect of titaniumsurface roughness on chondrocyte proliferation, matrix production, and differentiation depends on the state of cellmaturation J. J Biomed Mater Res, 1996, 30(2): 145-155.5 CURTIS A, WILKINSON C. Nantotechniques and approaches in biotechnology J. Trends Biotechnol, 2001,19(3): 97
36、-101.6 KAIVOSOJA E, BARRETO G, LEVON K, VIRTANEN S, AINOLA M, KONTTINEN Y T. Chemical andphysical properties of regenerative medicine materials controlling stem cell fate J. Ann Med, 2012, 44(7):635-650.7 ZHANG Y, FAN W, MA Z, WU C, FANG W, LIU G, XIAO Y. The effects of pore architecture in silk fib
37、roinscaffolds on the growth and differentiation of mesenchymal stem cells expressing BMP7 J. Acta Biomater, 2010,6(8): 3021-3028.8 MYGIND T, STIEHLER M, BAATRUP A, LI H, ZOU X, FLYVBJERG A, KASSEM M, BUNGER C.Mesenchymal stem cell ingrowth and differentiation on coralline hydroxyapatite scaffolds J.
38、 Biomaterials, 2007,28(6): 1036-1047.9 LEE J W, AHN G, KIM J Y, CHO D W. Evaluating cell proliferation based on internal pore size and 3Dscaffold architecture fabricated using solid freeform fabrication technology J. J Mater Sci Mater Med, 2010,21(12): 3195-3205.10 CHEM M, WANG X, YE Z, ZHANG Y, ZHO
39、U Y, TAN W-S. A modular approach to the engineering of acentimeter-sized bone tissue construct with human amniotic mesenchymal stem cells-laden microcarriers J.Biomaterials, 2011, 32(30): 7532-7542.11 PENG Z, LI Z, SHEN Y, ZHANG F, PENG X. Fabrication of Gelatin/Chitosan Microspheres with DifferentM
40、orphologies and Study on Biological Properties J. Polymer-Plastics Technology and Engineering, 2012, 51(7):739-743.12 PAMULA E, BACAKOVA L, FILOVA E, BUCZYNSKA J, DOBRZYNSKI P, NOSKOVA L,-8-GRAUSOVA L. The influence of pore size on colonization of poly(L-lactide-glycolide) scaffolds with human255260
41、osteoblast-like MG 63 cells in vitro J. J Mater Sci Mater Med, 2008, 19(1):425-435.13 AUBIN J E. Regulation of osteoblast formation and function J. Rev Endocr Metab Disord, 2001, 2(1): 81-94.14 CHENG S L,YANG J W, RIFAS L, ZHANG S F, AVIOLI L V. Differentiation of human bone marrowosteogenic stromal
42、 cells in vitro: induction of the osteoblast phenotype by dexamethasone J. Endocrinology,1994, 134(1): 277-286.15 BERESFORD J N, BENNETT J H, DEVLIN C, LEBOY P S, OWEN M E. Evidence for an inverserelationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultures J. JCell Sci, 1992, 102 ( Pt 2): 341-351.16 STEIN G.S, LIAN J B. Molecular mechanisms mediating proliferation/differentiation interrelationshipsduring progressive development of the osteoblast phenotype J. Endocr Rev, 1993, 14(4): 424-442.265-9-
