1、单克隆抗体的制备,许宁 南京医科大学卫生部抗体技术重点试验室,一、概论,抗体的研究已有百余年的历史 白喉杆菌抗毒素 抗体的定义 免疫球蛋白：结构概念 抗体：功能概念 与相应抗原特异结合具有免疫功能的球蛋白,抗原,抗原：能与抗体结合的物质 免疫原：可刺激产生抗体 半抗原 只能结合，不能诱发 与载体结合 抗原决定簇：表位,抗体生产技术作为抗体研究的基础得到迅速发展 抗体生产技术的三个时代 多克隆抗体 单克隆抗体 基因工程抗体,基因工程抗体 人源化 全人源 小型化 噬菌体抗体库,随着分子生物学发展，单抗技术有了新的突破 嵌合抗体 改型抗体 人源化抗体 转人基因小鼠,杂交瘤系统 小鼠杂交瘤系统大鼠杂交
2、瘤系统兔杂交瘤系统人杂交瘤系统 人脾细胞/淋巴细胞鼠骨髓瘤细胞人脾细胞/淋巴细胞人骨髓瘤细胞,三、单克隆抗体的制备,生物方法：病毒诱导 化学方法：PEG融合 物理方法：电融合,融合前的准备,抗体检测方法的建立 针对抗体的特异性：ELISA 针对抗体使用目的 WB 细胞染色 免疫组化,小鼠的标记 染色法（常用） 3.5%5%的苦味酸溶液 先左后右，从前到后 双色：双位数 打孔法 戴环法,免疫小鼠 一般选择健康8-12周龄的雌性BALB/C小鼠：融合用骨髓瘤细胞多来自此品系小鼠 常用的免疫途径：腹腔注射：完全福氏佐剂-初次不完全福氏佐剂-加强静脉注射脾内包埋、注射：抗原少、快速、高效,3. 一般要
3、经过初次免疫、加强免疫、冲击免疫三个过程 4. 免疫前取血作阴性对照，加强免疫时取血检测特异性抗体的产生和效价，决定冲击免疫和融合时机,免疫流程 每只小鼠100g抗原与完全福氏佐剂等量混匀，腹腔注射 24周后，同量抗原加不完全福氏佐剂追加免疫一次（检测抗体效价，必要时重复步骤2） 同量抗原不加佐剂静脉冲击免疫一次 冲击免疫后34天获取小鼠脾细胞,亲本细胞的选择,骨髓瘤细胞： 本身不分泌抗体 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）的骨髓瘤细胞 B淋巴细胞： 经特定抗原免疫能产生目的抗体 免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近亲源关系,细胞准备复苏
4、小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞，培养至细胞对数生长期,融合,收集小鼠脾细胞 取血：阳性血清、减少脾内红细胞 处死小鼠 消毒小鼠：75%酒精浸泡 取出脾脏：分层打开、更换器械 分离脾细胞：研磨法、注射法 离心收集（1500rpm,5min）,收集骨髓瘤细胞（1500rpm,5min）,无血清培养基分别冲洗脾细胞和骨髓瘤细胞各三遍 细胞计数：脾细胞/骨髓瘤细胞=2-10/1,融合：均在37水浴中进行，加入融合剂时需连续搅拌 1min：0.7ml PEG加入混合细胞中 2min：继续搅拌 3min：1ml无血清培养液 4min：3ml无血清培养液 5-8min：加至30ml 离心：800-1000rpm,
5、5min 加入HAT选择培养基 铺板,注意事项1. PEG： MW 10004000浓度 30%50%作用时间2. 培养液缓缓加入：渗透压改变3. 加入和倾倒PEG时均需彻底,融合细胞的选择原理,HAT选择培养基 荧光流式细胞仪（FACS）分选,A. HAT选择培养基 1964年Littlefield首先发明了HAT（HHypoxanthine次黄嘌呤，AAminopterin甲氨喋呤，TThymidine 胸腺嘧啶核苷）培养基的选择培养 HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的,细胞内DNA的生物合成途径,主要生物合成途径,补救途径,甲氨喋呤,次黄嘌呤,次黄嘌呤核
6、苷酸,HGPRT+,TK+,胸腺嘧啶,胸腺嘧啶 脱氧核苷酸,DNA,小鼠HGPRT-骨髓瘤细胞（Sp2/0） 融合后的细胞在HAT选择培养基中结局,Sp2/0,+,B,Sp2/0,Sp2/0,B,B,Sp2/0,B,死亡,死亡,存活,B. 荧光流式细胞仪分选（FACS法）两种颜色荧光素分别标记两种融合细胞异硫氰酸荧光素（FITC）罗丹明筛选同时有两种荧光素的融合细胞所筛细胞直接接种96孔板,融合后的管理,换液 Day 3：半量换液 Day 7：半量换液 观察融合细胞生长状况，有无细胞克隆的出现,检测 一个高倍视野大小 检测上清 间接法筛选阳性孔入24孔板扩增,亚克隆 软琼脂克隆法 有限稀释法(
7、常用) ：从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，经逐步稀释，使每孔只有一个细胞,3,3,3,2,4,4,4,4,4,2,2,2,4,4,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,亚克隆细胞的培养 添加饲养细胞：胸腺细胞 提高血清浓度：20% 添加细胞因子：IL-6，胰岛素,多次亚克隆（2-3次） 确保每个孔中只有来自于一个细胞的克隆群 淘汰核型不稳定的克隆，获得稳定基因型和稳定分泌抗体的克隆,扩增培养、冻存细胞,四、单克隆抗体的大量获得与纯化,小鼠腹水诱导,细胞培养上清,体外培养 培养上清中的牛血清影响纯化效果 逐步降低培养基中血清浓度20%-10%-5%-2.5%-1%-0把握时机 专用无血清培养基 生
8、物反应器（Bioreactor）,体内培养 小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞，诱导含有大量单克隆抗体的腹水 将对数生长期杂交瘤细胞洗涤后重悬于无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液中注射 接种前一周需用降植烷处理小鼠腹腔，抑制腹腔免疫系统，有益于杂交瘤接种 抗体效价高，但可能被小鼠自身抗体污染,实 验 内 容,腹腔注射 小鼠眼眶取血 处死小鼠 原代细胞的分离、培养,腹腔注射：用左手拇指和食指紧紧抓住颈部背的皮肤，手掌成杯状紧握鼠背，同时用小指压住尾根，固定好动物抬高小鼠腹部，右手将注射器的针头刺入左下腹皮肤针尖通过腹肌后抵抗力消失，固定好针尖，缓缓注入液体为避免刺破内脏，可将小鼠头部放低，尾部抬高，使脏器移向横膈
9、处,小鼠眼眶采血：先将鼠倒持，压迫颈部，使眼球突出充血，酒精棉球局部消毒，用毛细管或塑料管沿眼角向后、下方插入眼底静脉丛，血可从毛细管中自然流出,脾细胞分离：拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中消毒体表用剪刀依次剪开小鼠腹部皮肤和腹膜，暴露腹腔，取出脾脏，剃除周围结缔组织和脂肪，无血清培养液冲洗一次后置于100目不锈钢网中轻轻研磨脾脏，并用无血清培养液冲洗，收集脾细胞悬液，以1000rpm 离心5min，弃上清，重悬浮于不完全培养液中,谢 谢,细胞计数血细胞计数板,血细胞计数板的构造,计数室的划格,计数室充液法,细胞计数顺序,计算方法镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细 胞只计左侧和上方的。计算公式： 细胞数/ml4大格细胞总数/ 410000 注意：镜下若见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。,
