1、分子生物学在慢粒（AML）的发病机理、基因诊断及治疗中的应用,一、概述,慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia， CML)简称慢粒。,概念：是一种发生在早期多能造血干细胞上的恶性骨髓增殖性疾病（获得性造血干细胞恶性克隆性疾病)。,Chronic myelogenous leukemia, chronic phase.,病因：CML的病因比较复杂，较为公认的致病因素是电离辐射，如X射线、射线等。暴露于辐射的人群有较高的CML发病率。日本广岛及长崎原子弹辐射后，慢粒的发病率较未照射人群高17倍。 主要特点：本病病程发展缓慢，外周血粒细胞显著增多且不成熟，脾脏明显肿大。自
2、然病程可经历慢性期、加速期和急变期，多因急性变而死亡。本病各年龄组均可发病，以中年最多见。,二、CML分子生物学发病机理,Ph染色体与融合基因90%以上的慢粒患者中可发现有Ph染色体，即t(9；22)(q34；q11)，9号染色体q34上的原癌基因c-ABL的片段易位至22号染色体q11上的断裂点簇集区（breakpoint cluster region，BCR），产生BCR-ABL融合基因。这也是人类在白血病染色体易位中发现的第一个融合基因。,Cytogenetic Abnormality of CML: The Ph Chromosome,9,22,Bcr-abl融合基因致病的分子机制,B
3、cr/abl融合基因的编码产物p210、p230等融合蛋白具有很强的酪氨酸蛋白激酶活性，可激活结构性酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）。而酪氨酸激酶是一种催化ATP-磷酸酶转移到蛋白质酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白酪氨酸残基磷酸化，进而激活细胞中多种信号转到途径，促进细胞增殖，减少细胞凋亡，最终导致慢性粒细胞白血病的发生。,三、BCR-ABL融合基因的分子生物学检测技术,1.RT-PCR ：是以 mRNA 为模板反转录出cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR，是在 RNA 水平上检测 BCR-ABL 融合基因。该方法灵敏度高，可用于 MRD 的检测，但反转录-P
4、CR 是一种定性实验，不能对白血病患者的 BCR-ABL 融合基因给出定量分析，也可能会因 RNA 降解而出现假阴性。,2.实时定量荧光-PCR：是以荧光共振能量转移原理为基础，在 PCR 扩增的同时，加入引物的同时加入特异性的荧光探针; 是通过实验检测过程中的荧光强度变化对 PCR 扩增产物进行的一种定量检测方法。实时定量荧光PCR 由于其具灵敏度高( 10 5 10 6) 、可准确定量观察、迅速、重复性好等优点，在MRD 检测中具有非常重要的优势。,3.CBA 法：是指用已知大小及性质的磁珠与一组可溶的蛋白分析物结合，以检测人类血液样本的 BCR-ABL 融合蛋白。其检测试剂为一种结合藻红
5、蛋白( phycoerythrin，PE) 的单克隆抗体，可对 BCR-ABL 蛋白的 ABL 特异性结合，当免疫磁珠与 BCR-ABL 融合蛋白共混时，则可形成三明治状的复合物，蛋白的 BCR 端为结合了抗体的微球，ABL 端为结合了藻红蛋白的抗体。基于抗体的大小及性质，可使用流式细胞仪对该种复合物进行研究，从而检测出 BCR-ABL 融合蛋白。,BCR-ABL 融合基因可翻译产生融合蛋白可以被抗 BCR 的捕获磁珠及连接 PE 的抗 ABL 抗体结合。在流式细胞仪上对捕获磁珠的检测，可检测出 PE 的荧光信号。,4.FISH 法：是利用标记的 DNA 或 RNA 探针直接在染色体、细胞或组
6、织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量。主要应用于染色体易位形成的融合基因检测、基因缺失的检测及MRD检测等。具有快速、安全、经济、灵敏度高、特异性强等优点。对白血病临床疗效的判定及预测预后也具有重要意义。,5.Southern印迹(Southern Blot) 法可对bcr-abl融合基因DNA重排进行分子生物学检测。将待测基因组DNA片段经电泳分离后转移到固相杂交膜上，用取自M-bcr3和5端的bcr探针与之杂交，经放射自显影洗片后即可显示所要检测的条带，对于CML患者，除可见到一条与胚系bcr基因组DNA相对应的条带外，其他的条带说明存
7、在重排的bcr等位基因。,Southen 印记法实验流程图,四、分子靶向治疗（molecular targeting treatment）,信号传导抑制剂( Signal Transduction Inhibitor , STI),分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂,甲磺酸伊马替尼（imatinib mesylate），商品名为格列卫，为治疗CML的常用分子靶向药物。属小分子化合物，是一种特异性很强的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）。对体内众多酪氨酸激酶，它仅能抑制BCR-ABL融合基因产物P210和P190、PDGFR（血小板衍化生长因子）与c-Kit受体的酪氨酸激酶。,格列卫药理作用的分子机制,格列卫
8、通过特异性地与BCR/ABL激酶结构域的ATP位点结合，抑制其酪氨酸激酶活性,使酪氨酸残基不能磷酸化，从而抑制其细胞信号传导途径,促使细胞凋亡和抑制Ph阳性白血病细胞的增殖。 格列卫是CML治疗史上的里程牌,并且对CML具有很好的疗效，可使患者达到遗传学或分子生物学缓解。,Mechanism of action of imatinib.,By occupying the ATP binding pocket of the ABL kinase domain, imatinib prevents substrate phosphorylation and downstream activation of signals, thus inhibiting the leukemogenic effects of BCR-ABL on cells in chronic myelogenous leukemia. P = phosphate group.,
