1、Molekulris diagnosztika - ltalnos s orlis patofiziolgia szeminrium,Dr. Varga Gbor Orlbiolgiai Tanszk, Semmelweis Egyetem Budapest2010,Pldk a molekulris diagnosztika eszkzrendszernek alkalmazsra,Cysticus fibrosis Osteogenesis imperfecta Dentinogenesis imperfecta Amelogenesis imperfecta Hypohidrotikus
2、 ectodermalis dysplasia A szjregi-nyaki rgi daganataiGnterpia Human genom projekt,A genetika, a genomika s a gnterpia orlis/dentlis alkalmazsnak nhny kzenfekv terlete A fogfejlds genetikai betegsgei A fej-nyak rgi rkos betegsgei Caries kpzds s fogerzi prevencija Csontdefektusok korrekcija Krnikus fj
3、dalom cskkentse Parodontlis gyullads kezelse Nylmirigyek cskkent mkdsnek gygytsa Szisztms betegsgek kezelse nylmirigyek gnterpijval,Az rktanyag,Sejtjeink valamennyi letmkdse az rktanyagukban trolt program szerint jtszdik le. Az rktanyag a sejtmagban lv kromoszmkban tallhat. A kromoszmk legfontosabb
4、alkotrsze a DNS.,sejt,sejtmag,kromoszma,A szekvencia a DNS-molekulk replikcija sorn addik tovbb. A DNS-molekulk replikcija szemikonzervatv: az egyik szl vltozatlanul tovbbaddva templtknt szolgl az jonnan kszl szl szintzishez.,A DNS replikcija,A gnek,A DNS-nek azt a szakaszt, amely egy adott tulajdon
5、sgunkat hatrozza meg, gnnek nevezzk.,DNS,Kromoszma,egyik gn,msik gn,Hogyan mkdik egy gn?,A sejtmagban a gnrl a transzkripci sorn egy n. RNS tirat kszl. Ezt hrviv RNS-nek nevezzk. A hrviv RNS (mRNS) a sejtmagbl kijutva a riboszmhoz kerl. A riboszmn kszl el a transzlci folyamn az tirat alapjn a fehrje
6、. Az informci irnya teht: DNS RNS fehrje,SEJTMAG,maghrtya,DNS,fehrje,riboszma,gn,hrviv RNS,mRNS,fehrje,Az aminosavak genetikai kdja bzishrmas,Az aminosavak genetikai kdja,Molekulris diagnosztikai mdszerek,Southern blot (polinukleotid hibridizci) Northern blot (polinukleotid hibridizci) Western blot
7、(specifikus ellenanyagktds) Polimerz lncreakci (PCR) (gyakran reverz transzkripci utn) (oligonukleotid hibridizci) DNA szekvenls (nucleotid szintzis/lebonts kvetse specifikusan festd nucleotidokkal) DNA array - DNA chip technolgia (polinukleotid hibridizci),A reverz transzkripci,Reverz transzkripcih
8、oz RNS-vrusokbl (pl. M-MLV = Moloney egr leukmia vrus) izollt RNS-dependens DNS-polimerzokat, n. reverz transzkriptzokat alkalmazunk. A reverz transzkriptzok ribonukleotid egysgek egyszl DNS-be plst katalizljk templtfgg mdon. Templtjuk az RNS. A reverz transzkriptzoknak is szksgk van primerre. Lehet
9、sges primerek: random hexamerek, oligo(dT)1218, gnspecifikus anti-sense primer.,AZ “GTJAK”,Southern blot, Northern blot, Western blot, A DNS-t restrikcis enzimekkel emsztjk A kapott fragmentumokat glelektroforzissel mret szerint elvlasztjuk A glt lgban ztatjuk, hogy a DNS denatu-rldjon, majd az egsz
10、et savval semlegestjk blottols nitrocellulz membrnra jells radioaktv DNS-sel, RNS blottolsa, majd jells radioaktv DNS- vagy RNS-el, Fehrje blottolsa, majd jells radioaktvan vagy enzimatikusan jellt antitesttel,SOUTHERN BLOT,NORTHERN BLOT: AZ RNS,RNS = ribonukleinsav a citoplazmban s a sejtmagban is
11、megtallhat ptelemei: bzisok (A,G, C, U) ribz, foszft csoport, egyszl, de ez nem jelenti azt, hogy egyenes is,TOTL RNS IZOLLSA, ultracenrifuglssal (UC), Kit-ek segtsgvel, pl. a fagyasztott szveteket mozsrban folykony nitrogn alatt porr trjk., fenol/kloroformos extrakcival, kicsaps LiCl-dal vagy alkoh
12、ollal, Spektrofotometris mrssel a 260 nm-en mrt OD-bl az RNS oldat koncentrcija az albbiak szerint szmolhat:,GLELEKTROFORZIS,Az RNS mintk felvitele a zsebbe,A foszft csoportok miatt negatv tltssel rendelkez RNS molekulk a negatv plustl a pozitv plus fel vndorolnak.,formaldehidet tartalmaz denaturl g
13、l,Negatv (-) elektrd,Pozitv (+) elektrd,puffer,A vndorls irnya,futtat kd,A nagyobb molekulk lassabban, mg a kisebbek gyorsabban vndorolnak a gl prusai kztt s ezrt tvolabb kerlnek a kiindulsi ponttl.,GLELEKTROFORZIS II,Teht az elvlaszts a mret szerint trtnik.,A,B,bzis-prosodott rgi,De elfordulhat, ho
14、gy gynevezett hajt formk jnnek ltre. Ekkor viszont a molekulatmeg egyezse mellett is a mretek klnbzek lesznek. A B szerkezet molekula gyorsabban fog haladni a glben, mint az A.,Ezt elkerlend denaturl krlmnyeket alkalmaznak, vagyis formaldehidet a glben s a RNS felvitelhez alkalmazott gynevezett mix
15、oldatban.,KAPILLRIS BLOTTOLS,membrn,HIBRIDIZCI, A hibridizls sorn a komplementarits elvt hasznljuk fel. Lnyege: szekvencia- vagy alak-specifikus felismers, mely kt molekula egymshoz ktdsekor jn ltre, pl. egy DNS dupla-helix kt szla ktdik egymshoz, mert komplementerek, Ugyanez az elv valsul meg egy s
16、zonda (prba) molekula s egy “cl “molekula kztt, melyek egy komplexet alkotnak., Ez a komplex lokalizlhat, ha a szonda radioaktvan vagy enzimatikusan jellve volt. A komplex lokalizcija pedig informcival szolglhat a “cl” molekulrl.,JELLS,HIBRIDIZCI III,+,=,jszakn t 42C-on,Egy sok komponensbl ll hibrid
17、izl oldatban a membrnt elinkubljuk, majd a szonda hozzadsa utn hibridizltatjuk,WESTERN BLOT,A fehrjk komplex molekulk, klnbzhetnek mretben, tltsben, alakban (elsdleges, msodlagos, harmadlagos s negyedleges szerkezet), funkciban s szekvenciban. Ami viszont mindegyikre igaz, hogy az aminosav szekvenci
18、a egyenes, nem algaz.,rdekelhet bennnket egy fehrje olyan szempontbl, hogy milyen gygyszerhatssal rendelkezik vagy megismersvel egy metabolikus folyamat jobban rthetbb vlhat. Az eltr clok eltr fehrjetiszttsi s eltr fehrje kimutatsi mdok kidolgozst hvtk letre.,DNS fehrjeFontos tudni a DNS transzkripc
19、i s mRNS transzlci folyamatt,WESTERN BLOT II,Minta preparls: Kisebb nagyobb eltrsekkel ugyanaz a mdszer alkalmazhat sejtekbl s/vagy szvetekbl trtn izolls esetn. Mindegyiknl fontos, hogy:* jgen legyenek a mintk,* protez inhibtor koktlt alkalmazzunk,* tiszta, szennyezdsmentes eszkzket alkalmazzunk,* g
20、yorsan kell dolgozni!,Koncentrcimrs:* abszorpcis mrs 280 nm-en UV-ban (DNS tartalom bezavarhat)* Bradford kolorimetris mrs 550-600 nm-en specifikus, a funkcionlis egysggel reagl festk hozzadst kveten. Pl. Coomassie Brilliant Blue G-250 festk a bzikus s aroms aminosav rszhez, pl. arginin-hez ktdik.,W
21、ESTERN BLOT III,Natv elektroforzis: az elvlaszts alapja a fehrjk eltr tltse, mely jellemz egy adott pH-n. Sok lizin = ersen pozitv tlts, sok aszparaginsav rsz = ersen negatv tlts Ennek megfelelen valamelyik a pozitv, valamelyik a negatv plus fel fog vndorolni.,Denaturl PAGE = poli (30% acrilamid:bis
22、akrilamid) glelektroforzis minden fehrje rendelkezik hidrofb rszekkel, ami kpes detergens anyagokhoz ktdni, mint pl. a ntrium dodecyl szulfthoz (SDS). Ezltal vlik minden fehrje negatvv s ez egyenesen arnyos a fehrje tmegvel, teht az elvlasztst tovbbiakban csak a mret fogja meghatrozni.,WESTERN BLOT
23、IV,Ktfle pufferrendszert hasznlnak:sszefgg: egyfle szeparl gl van s ugyanaz a puffer a glben s a tankbannem sszefgg: a szeparl vagy “running” gl felett egy nem-korltoz, nagy prus (4%) “stacking” gl is tallhat.,(feszltsg)*(tlts) (srlds a molekuln),A glben a mobilits=, 1/molekulatmeg,MERT:az SDS minde
24、n molekula krl a mretnek (tmeg) megfelel negatv tltst hoz ltre,egy futtats sorn az alkalmazott feszltsg minden minta esetn azonos.Dithiothreitol (DTT) vagy 2-merkaptoetanol segtsgvel felbontjuk a cisztein rszek kztti szulfidhidakat. SDS s DTT egyttesen neutralizlja a fehrjk alakjt.,WESTERN BLOT V,Na
25、gyon fontos kivlasztani az adott fehrje elvlasztshoz legmegfelelbb %-os glt.,Stacking gl,Running gl,-,+,WESTERN BLOT VI,Kimutats a futtats utn:festssel (pl. Coomassie Brilliant Blue (R-250, G-250), Amido Black 10B, Serva Violet, and Fast Green FCF). Az eltr festkek eltr kimutathatsgi hatrral rendelk
26、eznek.Ezt kveti minden esetben egy metanol:ecetsavban trtn ztats, ami a glmtrixbl eltnteti a festket, s vgeredmnyben csak a fehrjhez kttt festkcskok fognak ltszdni.,WESTERN BLOT VII,Blottols:clja, hogy a mret szerint elvlasztott fehrjket szilrd felletre, lt. nitrocellulz vagy PVDF (polyvinylidene di
27、fluoride) membrn felletre vigyk t.Ez ltalban elektromos ram segtsgvel trt-nik, de a hagyomnyos kapillris blottolssal is megoldhat.,Blokkols: BSA vagy zsrszegny tejporral,WESTERN BLOT VIII,Detektls:direkt: specifikus antitestekkel, mely az ltalunk rdekes fehrje epitp ellen lett termeltetve. Az antite
28、st vagy fluoreszcens festkhez (UV-ban deteltlhat) vagy valamilyen enzimhez (tormaperoxidz=HRP) van ktve. Ez utbbi chemilumineszcens reakcit idz el, vagyis kmiai reakciban fny keletkezik, ami azutn rntgen filmen rgzthet.,A polimerz lncreakci (PCR),Mit tud? A PCR arra alkalmas, hogy DNS-molekulk kompl
29、ex elegybl egy ltalunk kivlasztott tetszleges DNS szakaszt specifikusan felsokszorozzunk. Mire j ez neknk? Pldk a PCR alkalmazsi terleteire: leukmikban, limfmkban kromoszma-transzlokcik, krokozk, monoklonalits kimutatsa igazsggy (VNTR PCR: gyilkossg, nemi erszak, apasgi perek) Hogyan lehetsges ez? A
30、 PCR a DNS replikci, ill. a DNS-polimerzok nhny sajtossgt hasznlja ki.,puffer (10 mM TrisHCl pH 8,39,0; 50 mM KCl; 0,01% Triton X-100)templt DNS (kb. 0,5 g) primer (0,10,6 M) DNS-polimerz (0,52,5 U / 50 l) Mg2+ (15 (ltalban 1,5) mM) dNTP (50500 (ltalban 200) M egyenknt) egyb adalkok nuklezmentes krl
31、mnyek PCR kszlk (programozhat termosztt),Ami egy PCR-hez kell,PCR folyamatbra,Animci: http:/www.dnalc.org/shockwave/pcranwhole.html,denaturls: 9496 C,primerek ktdse: 5065 C,DNS szintzis: 72 C,A PCR-ben hasznlt DNS-polimerzok,Eleinte E. coli DNS-polimerz I-et hasznltak PCR-hez, m ez a templt denaturl
32、sra alkalmazott hmrsklen inaktivldik, ezrt minden ciklusban j alikvotot kellett a reakcielegyhez adni. Ksbb termofil sbaktriumok (Thermus aquaticus, - thermophilus, Pyrococcus furiosus, - woesei) hstabil DNS-polimerzait kezdtk alkalmazni. Hstabil polimerzok tulajdonsgai:,A PCR termociklus,t,t,T,II.
33、Annells (40-60oC) a primerek a komplementerszekvencikhoz kapcsoldnak,III.polimerizci (72oC) DNS replikci hstabil DNS polimerzzal,SNP (egypontos nukleotid varici,single nucleotide polymorphism),4,3 milli bekldtt SNP 2,7 milli ref SNP (humn),2002. mjus,Mutcik adatbzisa: http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/omim
34、/,SNP-k s pontmutcik vizsglata,Alapelv: a klnbz varinsok hossza nem klnbzik, csak a bzissorrend tr el (egyetlen helyen),a szekvenciabeli eltrst hosszklnbsgg kell alaktani,PCR- RFLPRestrikcis fragmentumok hosszsg(lenght) polimorfizmusa,plda: DRD4 promoter 521CT SNP,DRD4 promoter 521CT SNP,GTCCGGTCCC
35、GGGACCCCCT GCCCAGGGTC AGAGGGGCGC CTACCTAGCT CACGGTCTTG GGCCGGAGGG AATGGAGGAG GGAGCGGGGT CGACCGCTCA GCTGTCCGCC CAGTTTCGGA GGCGGCCACG CGAGGATCAA CTGTGCAACG GGTGGGGCCG CGGCTGACCG TGGTGGTCGC GGGGGCTGAG GGCCAGAGGC TGCGGGGGGG GGGCGGCGGG ATGAGCTAGG CGTCGGCGGT TGAGTCGGGC GCGGAGTCGG GGGCAGGGGG AGCGGGCGTG GAG
36、GGCGCGC ACGAGGTCGA GGCGAGTCCG CGGGGGAGGC GGGCAGAGCC TGAGCTCAGG TCTTTCTGCG TCTGGCGGAA CGGGCCTGGG AGGGAGGTTT TGCCAGATAC CAGGTGGACT AGGGTGAGCG CCCGAGGGCC GGGACGCACG CACGGGCCGG GTAGGATGGC GCTGGCGTCG ATGCCCGCGC GCTTCAGGGC CTGGTCTGGC CGCCCCTCCA TCCTTGTCGG TTTCTCGGGT CGCGGACCCC GCGCGGCGCC GGGCGATGCT GGCCTG
37、CCCG TGGCCACCAC CTCGCTTCAT TCCCGTCTCT TTGGGCCGCC GCATTCGTCC ACGTGCCCGT CTCTCCCTGC GCAAAATTCC AAGATGAGCA AATACTGGGC TCACGGTGGA GCGCCGCGGG GGCCCCCCTG AGCCGGGGCG GGTCGGGGGC GGGACCAGGG TCCGGCCGGG GCGTGCCCGA GGGGAGGGAC TCCCCGGCTT GCGACCCGGC GTTGTCCGCG,521CT SNP,SNP-k vizsglata: (RFLP),DRD4 promoter 521CT
38、 SNP,GTCCGGTCCC GGGACCCCCT GCCCAGGGTC AGAGGGGCGC CTACCTAGCT CACGGTCTTG GGCCGGAGGG AATGGAGGAG GGAGCGGGGT CGACCGCTCA GCTGTCCGCC CAGTTTCGGA GGCGGCCACG CGAGGATCAA CTGTGCAACG GGTGGGGCCG CGGCTGACCG TGGTGGTCGC GGGGGCTGAG GGCCAGAGGC TGCGGGGGGG GGGCGGCGGG ATGAGCTAGG CGTCGGCGGT TGAGTCGGGC GCGGAGTCGG GGGCAGGGG
39、G AGCGGGCGTG GAGGGCGCGC ACGAGGTCGA GGCGAGTCCG CGGGGGAGGC GGGCAGAGCC TGAGCTCAGG TCTTTCTGCG TCTGGCGGAA CGGGCCTGGG AGGGAGGTTT TGCCAGATAC CAGGTGGACT AGGGTGAGCG CCCGAGGGCC GGGACGCACG CACGGGCCGG GTAGGATGGC GCTGGCGTCG ATGCCCGCGC GCTTCAGGGC CTGGTCTGGC CGCCCCTCCA TCCTTGTCGG TTTCTCGGGT CGCGGACCCC GCGCGGCGCC G
40、GGCGATGCT GGCCTGCCCG TGGCCACCAC CTCGCTTCAT TCCCGTCTCT TTGGGCCGCC GCATTCGTCC ACGTGCCCGT CTCTCCCTGC GCAAAATTCC AAGATGAGCA AATACTGGGC TCACGGTGGA GCGCCGCGGG GGCCCCCCTG AGCCGGGGCG GGTCGGGGGC GGGACCAGGG TCCGGCCGGG GCGTGCCCGA GGGGAGGGAC TCCCCGGCTT GCGACCCGGC GTTGTCCGCG,521CT SNP,Fsp I,Fsp I,SNP-k vizsglata
41、: (Fsp I-RFLP),DRD4 promoter 521CT SNP,521CT,nem polimorf,1. PCR,605 bp,TT,CT,CC,Az RT-PCR specifitsa,A PCR optimalizlsakor ugyanazokra a szempontokra kell figyelni, mint genomi DNS-bl kiindul PCR esetn. Tovbbi problma: A sejtekbl, szvetekbl izollt RNS ltalban genomi DNS-sel szennyezett. Honnan tudj
42、uk, hogy amennyiben megkaptunk egy gnre jellemz PCR-termket, az valban az trd gn mRNS-bl kapott termk, vagy a genomi DNS-szennyezdst amplifikltuk? Lehetsges megoldsok: Tiszta RNS-t preparlunk (CsCl, ultracentrifuga). DNzzal emsztjk az RNS-mintinkat. Olyan primereket terveznk, melyek kt klnbz exonon
43、helyezkednek el (gy a genomi DNS-bl amplifiklt termk hosszabb lesz).,Mdszertani ttrsek,Automata DNS szekvenls kifejlesztse Polimerz lncreakci (PCR) Adatfeldolgozs fejldse (Bioinformatika),Az automata DNS szekvenls elve,Sznes szekvenls,A di-deoxi lncterminlson alapul,Terminl helyek,Szekvenl reakciele
44、gy: Mind a ngy dNTP Mind a ngy ddNTP klnbz szn fluorogn festkkelDNA polimerz, primer,+,index,Egy szekvenlsi eredmny:,DNS chip technolgia,A hibridizci alapelve,Kihorgsszuk” a keresett gntermket, azaz RNS-t. Itt a csalit” gy hvjk, hogy szonda (prba). Ez egy DNS- vagy RNS-darab, amely megegyezik a vizs
45、glt gn egy szakaszval. A keresett RNS a hal”, amire horgszunk. A hal megtallja a csalit, azaz a prba s a keresett gntermk felismeri egymst komplementer bzisaik prosodsa rvn.,A prbk szablyos rendben helyezkednek el egyms utn, mint a parton a horgszbotok.,Az RNS-ek kztt mindenfle van.,Ha kzlk valamelyiket egy prba flismeri, az “horogra akad”.,ponty,keszeg,csuka,Ha a halainkat megjelljk, akkor lthatk lesznek.,ponty,keszeg,csuka,Amelyik hal nem akadt horogra, az elszik.,ponty,keszeg,csuka,Amelyik hal nem akadt horogra, az elszik.,ponty,keszeg,csuka,A horgszbotok a valsgban,
