1、第三章 血细胞分析仪检验 第一节 血细胞分析仪检验原理 一、血细胞计数原理 二、白细胞分类（群）计数原理 三、血红蛋白检测原理 四、血细胞分析仪工作流程,第二节 血细胞分析仪检验参数及临床应用 一、血细胞分析仪检验参数 二、血细胞分析仪检验参数的临床应用,第三节 血细胞分析仪检验图形及临床应用 一、血细胞直方图及临床应用 二、血细胞散点图及临床应用,第四节 血细胞分析仪性能评价与全面质量控制 一、血细胞分析仪的性能评价 二、血细胞分析仪全面质量控制,血细胞自动分析技术具有多参数、操作简便、高度自动化、精密度高、速度快、注重环保、较强的质控功能、智能化、有效的筛检正常人群的功能等特点。,血细胞分
2、析仪（blood cell analyzer，BCA）是临床血液一般检查最常用的仪器，可进行全血细胞计数及其相关参数的检测。 以往使用手工操作显微镜计数方法,1953年美国Coulter公司成功研制了第一台电阻抗式血细胞计数仪.目前，已形成血细胞分析流水线。,血细胞分析仪类型较多，根据对白细胞的分析程度可分为二分群、三分群及五分类；根据其自动化程度可分为全自动与半自动：全自动仪器可直接使用抗凝血；半自动仪器须预先稀释血标本。,第一节 血细胞分析仪检验原理 目前，各类血细胞分析仪主要有两大功能：血细胞计数功能。白细胞分类功能。其检测原理为电阻抗法、激光散射法及多种方法联合应用。,一、血细胞计数原
3、理 （一）电阻抗法 血细胞分析仪计数血细胞多采用电阻抗法，这也是发展中的血细胞分析仪设计的基础。,其基本检测原理是：血细胞具有相对非导电的性质，悬浮在电解质溶液中的血细胞颗粒通过计数小孔时可引起电阻及电压的变化，出现脉冲信号，脉冲的数量代表细胞的数量，脉冲的大小代表细胞的大小，从而对血细胞进行计数和体积测定，这种原理又称库尔特原理（coulter principle）,2血细胞计数原理 将等渗电解质溶液稀释的细胞悬液置入不导电的容器中，将小孔管（也称传感器transducer）插进细胞悬液中，当接通电源后，位于小孔管两侧的电极产生稳定的电流，混悬细胞的稀释液可从小孔管外侧通过小孔管壁上的宝石小
4、孔（直径l00m，厚度约75m）向小孔管内部流动。,当细胞通过小孔时，在电路中小孔感应区内电阻增高，于是瞬间引起了电压变化而出现一个脉冲信号。这些脉冲信号经过放大、阈值调节、甄别、整形、计数及自动控制保护系统，最终可打印出数据报告（图3-2，3-3）。,图3-2电阻抗法细胞计数原理,图3-3血细胞脉冲信号与直方图关系,利用此原理可进行红细胞计数（RBC）、白细胞计数（WBC）、血小板计数（PLT）、红细胞平均体积（MCV）和血小板平均体积（MPV）测定等。,由于血小板和红细胞体积有明显的差异，很容易用一个限定阈值将两者同时测得的光电信号区分。因此，迄今全血法分析血小板与红细胞均采用一个共同的分
5、析系统。,根据不同的阈值，计算机分别给出红细胞和血小板数量。但由于血小板和红细胞测量信号常有交叉，例如大血小板的脉冲信号可能被误认为红细胞而计数；小红细胞的脉冲信号可能进入血小板通道，误认为血小板而计数，造成实验误差。,为此，某些血细胞分析仪设置了一些特殊的装置。扫流装置：仪器的红细胞计数微孔旁有一股持续的稀释液流，也叫扫流液体，其流向与计数微孔呈直角，使计数后的液体流走，可防止计数后颗粒重新进入循环而再次计数。,鞘流技术：避免计数中血细胞从小孔边缘流过及湍流、涡流的影响，保证血细胞单个依次通过计数孔。浮动界标：通过调节红细胞与血小板间的阈值，避免小红细胞及大血小板对计数的干扰,图3-4 电阻
6、抗法RBC和PLT检测原理,3红细胞及血小板的其他参数检测 血细胞比容（HCT）采用脉冲高度叠加经换算得出，或采用红细胞平均体积（MCV）与红细胞数相乘得到。红细胞平均体积（MCV）、血小板平均体积（MPV）由仪器直接测定导出。,MCH及MCHC由MCV值与仪器直接检测的红细胞数和血红蛋白含量经计算得到（MCH=HBG/RBC，MCHC=HBG/HCT）。,红细胞体积分布宽度（red cell volume distribution width，RDW）是由血细胞分析仪测量细胞体积后获得。,RDW是红细胞体积异质性的参数，即反映红细胞大小不等的客观指标。,RDW多采用RDW-CV和RDW-SD
7、表示。RDW-CV易受红细胞体积大小的影响（CV=SD/x），不能真实反映红细胞的大小及离散情况，而RDW-SD可弥补这一不足,图3-5 红细胞直方图及RDW范围,电阻抗法的缺点：不能探测单个红细胞的结构。由于MCHC数据来源于MCV的测量结果，而MCV测量受细胞体积以外诸因素的影响，最终造成MCHC的误差。,红细胞通过小孔时都经受一定的形态变化，红细胞形态与细胞质黏度有关，细胞质黏度受血红蛋白含量影响，故血红蛋白浓度可影响红细胞形态，也影响MCV及MCHC的准确性。血小板计数常受大血小板和非血小板颗粒（如小红细胞、红细胞碎片等）的干扰。,（二）流式细胞术与激光检测原理 1白细胞计数原理 利用
8、流式细胞术，单个细胞随着流体动力聚集的鞘流液通过激光照射的检测区时，使光束发生折射、衍射和散射，散射光由光检测器接受后产生脉冲，脉冲大小与被照细胞的大小成正比，脉冲的数量代表细胞的数量。,其优点是：细胞单个通过检测区，避免了细胞重叠。利用高角、低角等前向光可获得细胞的各相关数据，经综合分析可提高鉴别细胞的能力。,2红细胞计数原理 在散射法测试系统中，全血与红细胞/血小板稀释液混合，使自然状态下双凹圆盘状的红细胞成为球形并经戊二醛固定，其目的是使红细胞无论以何种方位通过测试区时，被激光束照射后所得的信号是相同的，此种处理并不影响MCV的检测。,以氢氖激光灯为光源，670nm激光束以低角度光散射（
9、23，测量单个红细胞体积与总数）和高角度光散射（515，测量单个红细胞血红蛋白浓度）同时测量1个红细胞，绘出红细胞散射图、单个红细胞体积及红细胞内HGB含量的直方图，得出MCV、MCH、MCHC、RDW、HDW等参数（图3-6）。,图3-6 激光法RBC检测原理,3血小板计数原理 根据同质性球体光散射的Mie理论（Mie theory of light scatter for homogeneous spheres），当球形化的血小板单个通过激光照射区时，高角度（5-15）主要检测细胞折射指数（refractive index，RI），此与细胞密度有关；低角度（2-3）主要测量细胞大小。,虽然
10、大血小板与小红细胞、红细胞碎片及其他细胞碎片的体积相似，但由于内容物不同，RI相差较大，因此能在血小板二维散射图上予以鉴别。,4网织红细胞计数原理 网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，是反映骨髓造血功能的重要指标。,显微镜目测法检测网织红细胞可直接观察细胞形态，且不需昂贵的设备，不失为诊断贫血的重要方法。,（1）流式细胞仪（flow cytometry，FCM）检测原理：在红细胞发育过程中，RNA含量有明显规律性变化，即由原始阶段较为丰富，然后逐渐减低，至细胞完全成熟后消失或接近消失。在FCM测量时，通过某些染料（如吖啶橙、哌若宁-Y、噻唑橙）与网织红细胞中RNA结合，发出特定颜色的荧光。进行R
11、NA定量可精确表示网织红细胞占成熟红细胞的百分率（RET）。,（2）网织红细胞计数仪检测原理：与流式细胞仪方法相比，主要有两个优点：FCM以哌若宁-Y、吖啶橙、硫磺素T或Diocl为染料，计数前标本需要固定和染色，而网织红细胞计数仪在血液与荧光素直接结合后即可测量。,网织红细胞计数仪用血量少，1份样本可分别进行自动血细胞分析和网织红细胞计数。其分析原理是以氩激光束为光源，碱性槐黄O（auramine O）为染料，与网织红细胞内RNA结合后，通过波长488nm的激光束时，仪器可同时测量前向角光散射强度（forward scatter，显示细胞大小）和测量荧光强度（显示胞内RNA的浓度）。,仪器显
12、示出的散点图可以反映网织红细胞的成熟阶段，根据荧光强度还可将网织红细胞分成low fluorescent reticulocyte(LFR）、middle fluorescent reticulocyte （ MFR）和high fluorescent reticulocyte(HFR）三部分。幼稚网织红细胞显示最强的荧光，反之，成熟红细胞极少或没有荧光（图3-7）,图3-7 网织红细胞计数仪检测原理,（3）全自动血细胞分析仪检测原理：全血细胞分析仪检测网织红细胞有两种类型：采用2种试剂：一种是新亚甲蓝，染色红细胞内RNA；另一种为“透明”剂，使红细胞内血红蛋白溢出成为“影细胞”，以减少测试的
13、干扰。,应用容量、电导、激光（VCS）的原理进行网织红细胞的检测，该仪器不但能检测有关白细胞、红细胞、血小板等的测量参数，还可得出RET绝对值、RET%、网织红细胞平均体积（MRV）和网织红细胞成熟指数（RMI）。,另一方法是先将3L血液加入已标准化的染液，孵育15min，将仪器转换至网织红细胞计数程序，即可得到网织红细胞参数,5有核红细胞计数原理 在有核红细胞通道中，表面活性剂可溶解红细胞膜，留下细胞核，白细胞膜不被溶解，胞质完整。试剂中的聚次甲基荧光染料可使白细胞和有核红细胞的核酸染色。应用半导体激光束照射标本，以前向散射光（细胞大小）为纵坐标，以荧光强度为横坐标，可将白细胞、有核红细胞和
14、影细胞区分出来（图3-8，3-9）。,图3-8 核酸染色NRBC检测分析过程,图3-9 NRBC检测NRBC散点图,二、白细胞分类（群）计数原理 （一）白细胞二分群、三分群计数原理 根据电阻抗的原理，不同体积的白细胞通过小孔时产生的脉冲大小有明显的差异，依据脉冲的大小，电阻抗法血细胞分析仪可对白细胞进行分群。,经溶血素处理后，红细胞迅速溶解，白细胞胞质经细胞膜渗出，胞膜紧裹在细胞核或颗粒周围。脱水的血细胞体积与其自然体积无关，取决于脱水后细胞内有形物质的多少。,仪器可将体积为35450fL的血细胞分为256个通道（channe1），每个通道为1.64fL，根据细胞大小分别置于不同的通道中，可初
15、步确认相应的细胞群，并显示出白细胞体积分布直方图（表3-1，图3-10）。,表3-1 电阻抗法白细胞的三分群,图3-10三分群血细胞分析仪白细胞分类模式图,根据各亚群占总体的比例，计算出白细胞各亚群的百分率；如果白细胞各亚群的百分率与同一标本的白细胞总数相乘，即得到各亚群细胞的绝对值。,电阻抗法血细胞分析仪白细胞分类只是根据细胞体积的大小，将白细胞分成几个群体，现一般使用“三分群”或“三分部”描述电阻抗法血细胞分析仪的白细胞分类。,电阻抗法白细胞的三分群,（二）白细胞五分类计数原理 1容量、电导、光散射（volume，conductivity，scatter，VCS）法 VCS技术是在血细胞未
16、经任何处理，保持着与体内形态完全相同状态下得出的检测结果。,首先在测试的标本内加溶血剂（erythro1ysin），使红细胞溶解；加入抗溶血稳定剂（stabilizer），中和溶血剂的作用，使白细胞表面、胞质及细胞大小等特征仍保持与体内时相同状态；使用鞘流技术，使溶血后液体内的白细胞分别单个通过激光检测区接受检测,图3-11 VCS法血细胞分类流程图,VCS法检测原理：应用电阻抗原理测量细胞体积技术。电导技术：根据细胞壁能产生高频电流的性能，用高频电磁探针测量细胞内部结构，通过细胞核和细胞质的比例、细胞内颗粒的大小和密度，辨别体积相同、但性质不同的两个细胞群体。,光散射技术：来自激光源的单色光
17、直接扫描计数敏感区的细胞，根据细胞产生的不同角度散射光（1070），提供细胞形态、胞核结构等光散射信息，并鉴别细胞颗粒的构型和质量（粗颗粒的光散射要比细颗粒更强）。,光散射可区别粒细胞（中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞）的类型。根据VCS原理，可显示3种细胞散点图（图3-12）、DF1（体积值和散射光值）、DF2（体积值和电导值）、DF3（体积值和电导值，但除去了嗜酸粒细胞和中性粒细胞部分，只显示嗜碱粒细胞群）,图3-12 VCS法正常白细胞分类散点图,2激光与细胞化学法 应用激光散射和过氧化物酶染色技术检测白细胞。,（1）激光与过氧化物酶检测通道：不同白细胞的过氧化物酶活性不同，从强到弱依
18、次为：嗜酸粒细胞、中性粒细胞、单核细胞，而淋巴细胞和嗜碱粒细胞则无。,因此，细胞经过氧化物酶染色后，胞质内即出现细胞化学反应，以X轴为吸光率（酶反应强度），Y轴为光散射（细胞大小）显示检测结果，每个细胞产生的这2个信号可定位在细胞散点图上。由于淋巴细胞和嗜碱粒细胞均无过氧化物酶活性，仪器获得白细胞4个亚群(EO、NEUT、MONO、LYM十BASO)。,（2）嗜碱粒细胞/分叶核细胞检测通道：该通道可进一步区分淋巴细胞和嗜碱粒细胞。嗜碱粒细胞/分叶核细胞利用“时间差”与红细胞/血小板使用共同的检测通道。,当血液进入嗜碱粒细胞通道时（此时红细胞、血小板已检测完毕），血液与酸性表面活性剂反应，红细胞
19、被溶解，除嗜碱粒细胞外，其他所有白细胞膜均被破坏，胞质溢出，仅剩裸核（图3-13）；激光照射嗜碱粒细胞后，产生散射光的变化，形成二维细胞图。完整的嗜碱粒细胞呈高狭角散射，定位于图的上半部，裸核位于图下半部（图3-14）。,图3-13嗜碱粒细胞/分叶核细胞通道试剂反应示意图,图3-14嗜碱粒细胞/分叶核通道白细胞分类示意图,3电阻抗与射频法 该类仪器通过4个不同检测系统进行检测。 （1）嗜酸粒细胞检测系统：血液进入仪器后，与嗜酸粒细胞特异性计数的溶血剂混合，pH值特殊的溶血剂可使除嗜酸粒细胞以外的所有细胞溶解或萎缩，因而通过小孔被计数的只有嗜酸粒细胞。,（2）嗜碱粒细胞检测系统：计数原理与嗜酸粒
20、细胞相似，在该系统特殊溶血剂的作用下，血液中被计数的只有嗜碱粒细胞。,（3）淋巴、单核和粒细胞（中性、嗜酸和嗜碱）检测系统：该系统采用电阻抗和射频（能透入细胞内，测量胞核的大小及颗粒的多少）联合检测方法，以直流电（direct current，DC）为横坐标，以射频（radio frequency，RF）为纵坐标，根据这两个信号把一个细胞定位于二维的细胞散射图上；,本法使用的溶血剂作用较轻，溶血剂对细胞核皱缩作用也较轻微，细胞形态改变不大，但淋巴细胞、单核细胞及粒细胞的大小、胞质量、胞质内颗粒大小与密度、细胞核形态与密度的不同，各类细胞的DC和RF有较大的差异，从而得以分类。电阻抗与射频法白细
21、胞检测原理和散点图见图,3-15电阻抗与射频法白细胞检测原理,图3-16电阻抗与射频法白细胞分类检测散点图,（4）幼稚细胞检测系统：根据幼稚细胞膜上脂质较成熟细胞少的特性进行检测。即在细胞悬液中加入硫化氨基酸，由于占位不同，结合在幼稚细胞上的氨基酸多于较成熟的细胞，且对溶血剂有抵抗作用，当加入溶血剂后，成熟的细胞被溶解，而幼稚细胞不被破坏，通过电阻抗法检测出来。,图3-17幼稚细胞检测系统检测原理,4多角度激光法 （1）半导体激光及流式细胞原理：采用半导体激光及流式原理从两个角度分析白细胞，并依据每个细胞产生的3种信号来互相区分，即前向散射光、侧向散射光和侧向荧光。前向散射光反映细胞体积（WB
22、C/BASO通道），侧向散射光反映细胞内涵物，如胞核和颗粒（DIFF及WBC/BASO通道），侧向荧光反映细胞DNA和RNA含量（DIFF通道）。,图3-18半导体激光及流式细胞原理,1）白细胞分类通道（DIFF通道）：此通道运用荧光和侧向散射光信号。表面活性剂溶解或破坏红细胞和血小板，并在白细胞膜上打出小孔。,聚次甲基染料可进入破损的白细胞，与核酸、细胞器结合，经波长633nm的激光照射，所产生的荧光强度与细胞核酸含量成一定比例。试剂中的有机酸能与嗜酸性颗粒特异结合，根据侧向散射光信号强度，能提高嗜酸粒细胞从中性粒细胞内的区分能力。从荧光和侧向散射光获得白细胞四个亚群（LYM、MONO、EO
23、、NEUTBASO）（图3-19）。,图3-19 半导体激光及流式细胞WBC分类散点图,2）WBC/BASO通道：此通道运用前向和侧向散射光信号。酸性试剂可引起除嗜碱粒细胞外的红细胞（影红细胞）、血小板（影血小板）和白细胞（裸核）溶解和皱缩，因而此通道可检测白细胞和嗜碱粒细胞（图3-20）。,图3-20 WBC/BA通道试剂作用后血细胞的变化,试剂中的表面活性剂作用于细胞，可形成影红细胞、影血小板和除嗜碱粒细胞外的裸核白细胞。根据前向散射光和侧向散射光，使嗜碱粒细胞和其他细胞因容积差异而被区分。嗜碱粒细胞形成独立群体，核残余物也可从影细胞中区分出来。嗜碱粒细胞和裸核数之和代表白细胞总数（图3-
24、21）。,图3-21 半导体激光及流式细胞WBC/BA 散点图,（2）多角度偏振光散射（multi-angle polarized scatter separation of white cell，MAPSS）法：全血标本用鞘流液按适当比例稀释后，白细胞内部结构近似于自然状态，仅嗜碱粒细胞颗粒具有吸湿性而结构有轻微改变；红细胞内部的渗透压高于鞘液的渗透压，血红蛋白从细胞内溢出，水分子则进入红细胞，但红细胞膜结构仍保持完整。此时，红细胞折光指数与鞘液相当，红细胞不干扰白细胞检测。,当单个细胞通过激光束时，可从4个角度测定散射光的密度：0：前角光散射（13）可粗略测定细胞大小。10：狭角光散射（7
25、11）可测定细胞内部结构相对特征。90：垂直光散射（70110）测定细胞核分叶情况。90：消偏振光散射（70110），区分嗜酸粒细胞与其他细胞（图3-22）。,图3-22多角度偏振光散射法分类原理,三、血红蛋白检测原理 任何类型仪器的血红蛋白（HGB）测定原理基本相同。当稀释血液中加入溶血剂后，红细胞溶解并释放出HGB，HGB与溶血剂中的某些成分结合形成血红蛋白衍生物，进人HGB测试系统，在特定的波长（一般在530550nm）下进行比色。,吸光度的变化与稀释液中HGB含量成正比，仪器通过计算可显示出HGB的浓度。不同类型血细胞分析仪，由于溶血剂配方不同，所形成的血红蛋白衍生物也不同，吸收光谱各
26、异，但最大的吸收峰均接近540nm。,ICSH推荐使用氰化高铁法，HiCN最大吸收峰在540nm，各型号血细胞分析仪必须以HiCN值为标准进行校正。由于很多系列血细胞分析仪使用的溶血剂内均含有氰化钾，与HGB作用后形成氰化血红蛋白（不是氰化高铁血红蛋白），其特点显色稳定，最大的吸收峰接近540nm，而吸收光谱与HiCN有明显不同，因此，在仪器校正时应特别注意。,为了解决含氰的血红蛋白衍生物检测后的污物处理问题和减低溶血剂的毒性作用，有些血细胞分析仪使用非氰化溶血剂（如SLS，十二烷基月桂酰硫酸钠），其检测结果的精确度及准确性可达到含氰化物溶血剂的水平，使用非氰化溶血剂既能保证检验质量又可避免试
27、剂对检验人员的损伤和对环境的污染。,四、血细胞分析仪工作流程 全自动和半自动血细胞分析仪应用电阻抗法的工作流程图基本一致（图3-23）。,图3-23 血细胞分析仪检测流程图,第二节 血细胞分析仪检验参数及临床应用 一、血细胞分析仪检验参数 血细胞分析仪的检验参数主要包括血细胞的三大系列：红细胞系列参数、白细胞系列参数和血小板系列参数。有些血细胞分析仪还兼有检测网织红细胞的功能（表3-2、3-3、3-4）。,二、血细胞分析仪检验参数的临床应用 （一）红细胞参数 红细胞计数、血红蛋白测定、血细胞比容、红细胞平均指数的临床应用参见第二章。,1红细胞体积分布宽度（RDW） RDW是测定红细胞体积大小变
28、异的一个参数，以标准差或变异系数（CV%）表示，它是以红细胞直方图顶点的高度定为100%，自下而上高度为20%时的红细胞分布宽度。极度增高的RDW见于急性溶血性贫血和网织红细胞增多的情况。,（1）用于缺铁性贫血和轻型-珠蛋白合成障碍性贫血的鉴别：按病因学分类，小细胞低色素性贫血包括缺铁性贫血、铁粒幼细胞性贫血及珠蛋白合成障碍性贫血，RDW鉴别这三种贫血有重要意义。,缺铁性贫血病人RDW增高，轻型-珠蛋白合成障碍性贫血者RDW正常，且诊断的符合率分别是100%和88%，提示RDW可作为两者鉴别的参考指标。,RDW（大于14%）判断红细胞大小变化的灵敏度为100%，而观察血涂片的灵敏度只有71%。
29、-珠蛋白合成障碍性贫血的血涂片检查显示的红细胞大小不均，可能是异形红细胞增多（poikilocytosis）的结果。因此，血涂片检查为红细胞大小不均而RDW正常时，应进行-珠蛋白合成障碍性贫血的检查，以明确诊断。,（2）用于缺铁性贫血的早期诊断：由于各种原因造成机体内铁缺乏，导致HGB合成障碍而引起的小细胞低色素性贫血，其病程可分为缺铁前期、缺铁期及IDA三个阶段。随着贫血程度的加重，RDW逐渐增高。,（3）用于贫血的形态学分类：目前多使用MCV、MCH、MCHC三指数分类贫血，这种分类法对贫血鉴别诊断有一定意义。但此法忽视了由于红细胞体积异质性对MCV准确度的影响，不能全面反映红细胞的病理变
30、化。RDW和MCV对贫血新分类见表3-5。,贫血的RDW和MCV分类,2红细胞血红蛋白分布宽度（HDW） HDW是反映红细胞内HGB含量异质性的参数，用单个红细胞HBG含量的标准差表示，正常为2434g/L。HDW的临床意义见表3-6。,（二）血小板参数 1血小板计数 参见第二章第四节。 2血小板平均体积（MPV） MPV增高是表示活性强的新生血小板、是巨核细胞产生的碎片不均一性、是不同倍体的巨核细胞产生不同大小的血小板。MPV增高表示巨核细胞成熟度高，反之则低。在正常人，MPV与PLT呈非线性的负相关。在病理情况下，两者之间的关系并无这种规律。MPV与PDW联合检测的临床意义见表3-7。,（
31、三）白细胞参数 白细胞计数、白细胞分类计数临床意义见第二章第三节,（四）网织红细胞参数 1网织红细胞计数 网织红细胞绝对值、百分率和网织红细胞成熟指数测定是反映骨髓红细胞造血功能的重要指标。其临床意义见第二章第二节。,网织红细胞计数对诊断正细胞贫血，或仅铁蛋白、转铁蛋白饱和度结果可疑的小细胞贫血尤为重要。大细胞贫血伴网织红细胞增多症，常提示用叶酸或维生素B12治疗。网织红细胞计数鉴别正细胞、小细胞和大细胞性贫血见图3-24、图3-25、图3-26）。,图3-24 网织红细胞计数鉴别正细胞贫血,图3-25网织红细胞计数鉴别小细胞贫血,图3-26 网织红细胞计数鉴别大细胞贫血,2网织红细胞成熟指数
32、（RMI） 外周血RMI与贫血程度、疾病状况和铁状况有关。RMI参考值见表3-8。,RMI增高是骨髓红细胞造血功能的标志。当网织红细胞计数正常时，RMI业已升高。在较严重的急性失血，未成熟网织红细胞在58h后增高，而网织红细胞计数在2d内不会明显增高。,RMI增高常与骨髓移植、慢性溶血、近期出血或化学治疗反应相关，可见于溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癜、慢性淋巴细胞白血病和某些急性白血病病人。,RMI减低提示骨髓衰竭和造血无效；RMI太低与网织红细胞计数有关，见于网织红细胞成熟延迟，如珠蛋白生成障碍性贫血、慢性肾衰竭、恶性贫血和骨髓增生异常综合征。RMI和网织红细胞计数是相对独立的参数，作为
33、骨髓红细胞造血功能的标志，可用于进一步分类贫血。,第三节 血细胞分析仪检验图形及临床应用 血细胞分析仪在检测血细胞的同时还可获得相应的细胞分布图形，分析此类图形的变化，不仅可以评估仪器的工作状态或仪器是否受非检测成分（如冷球蛋白、聚集血小板及细胞碎片等）的干扰，而且可提示各类细胞比例（如白细胞分类、网织红细胞分群）的变化或血液内出现非正常血细胞（如白血病细胞）等。,一、血细胞直方图及临床应用 血细胞体积分布直方图（histogram）是用于表示细胞群体分布情况的曲线图形，横坐标为血细胞体积，纵坐标为不同体积细胞的相对频率。细胞直方图不仅可提供直观的检验结果，也有利于监控仪器工作状态及检测结果。
34、但是，由于不同类型仪器设置的参数和应用的试剂不同，即使是同一份标本，其细胞直方图也有差异。,（一）白细胞直方图 1正常白细胞直方图 电阻抗型血细胞分析仪，在35450fL范围内将血细胞分为3群（图3-10），分别为淋巴细胞峰（小细胞群）、单个核细胞峰（中间细胞群）、中性粒细胞峰（大细胞群）。出现异常直方图时，常伴随相应部位的报警信号，如“H（high，高）”或“L（low，低）”等，分别提示检测结果高于或低于参考值。,2白细胞直方图的意义 （1）图形变化决定进一步检查的内容：根据图形变化，决定是否进一步镜检，提示在显微镜分类时注意异常细胞的存在。,（2）白细胞直方图变化无特异性（表3-9）：例
35、如中间细胞群可包括大淋巴细胞、原始细胞、幼稚细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞，其中任一细胞增多，均可使直方图产生相似的变化。因此，异常的直方图只是粗略判断细胞比例变化或有无异常细胞，进而在显微镜检查中注意这些变化，或在正常人体检中筛选是否需要进行血涂片检查。,（3）反映某些人为或病理因素干扰白细胞计数和分类计数：外周血出现有核红细胞或巨大血小板、采血时由于技术原因造成血小板聚集、某些病理因素使红细胞膜对溶血剂有抵抗作用，致红细胞溶血不完全，标本中有大量红细胞膜碎片等，都可使白细胞直方图在50fL以下区域出现一个或大或小的峰。因此当检验结果出现这种图形时，提示白细胞计数和分类计数均不准确，需要采取相
36、应的手段进一步检测。几种白细胞直方图变化见图3-27，3-28，3-29，3-30,图3-27中性粒细胞增高,图3-28嗜酸粒细胞增高,图3-29单核细胞增高、中性粒细胞减少,图3-30淋巴细胞增多、中性粒细胞减少,3分析白细胞直方图应注意的问题,（二）红细胞直方图 1正常红细胞直方图 仪器在36360fL范围内分析红细胞，横坐标表示红细胞体积，纵坐标表示不同体积红细胞出现的相对频率。正常红细胞主要分布在50200fL范围内，在直方图上可见2个细胞群体，从50125fL区域有一个几乎两侧对称、较狭窄的正态分布曲线，主峰右侧约分布在125200fL区域的细胞，为大红细胞和网织红细胞（图3-5）。
37、红细胞体积大小发生变化，直方图峰可左移或右移，或出现双峰。,2红细胞直方图在贫血中的应用 不同类型贫血时，红细胞体积的变化使红细胞体积分布图形发生变化，结合其他参数对鉴别诊断颇有价值（表3-10，图3-31，3-32，3-33，3-34，3-35，3-36）。,图3-31轻型-珠蛋白生成障碍性贫血,图3-32缺铁性贫血治疗前,图3-33缺铁性贫血治疗后,图3-34 巨幼细胞性贫血,图3-35 巨幼细胞性贫血治疗后,图3-36 溶血性贫血,（三）血小板直方图 1正常血小板直方图 在230fL范围内分析血小板。正常血小板直方图呈左偏态分布，主要集中在215fL（图3-37）。 2血小板体积直方图的
38、意义 由于红细胞与血小板的检测在同一通道，小红细胞、细胞碎片及血小板自身的聚集等对血小板计数及平均血小板体积的影响很大，血小板直方图能反映这些变化，根据图形的变化可了解血小板计数的准确性。,图3-37电阻抗法血小板直方图,二、血细胞散点图及临床应用 （一）白细胞散点图 由电阻抗法发展起来的多项技术（激光、射频及化学染色等）联合检测白细胞，由于不同白细胞大小及内部结构（如胞核的大小、胞质颗粒的多少及酶的数量）不同，综合分析后的检验数据也不同，从而得出不同的白细胞散射图（scattergram）及较为准确的白细胞五分类结果。从图形的变化可以估计被测血液中某类细胞的变化（图3-38）。,白细胞散点图
39、的意义与直方图基本相同。,（二）红细胞散点图 红细胞散点图显示了光散射与细胞体积、血红蛋白浓度的关系，该图能反映体积在30180fL之间、红细胞血红蛋白浓度在190g/L490g/L的红细胞。,第四节 血细胞分析仪性能评价与全面质量控制 一、血细胞分析仪的性能评价 血细胞分析仪安装后或每次维修后，必须对分析仪的技术性能进行测试与评价。按照ICSH公布的血细胞分析仪评价指标对分析仪进行测试与评价，这对充分发挥血细胞分析仪的正常作用、为临床提供准确检验信息起重要作用。,1精密度（precision） 分批内及批间精密度（within and between batch precision）。评价项
40、目的结果应覆盖整个病理范围，因此应该选择低、中、高值不同浓度的标本。评价程序是：选择低、中、高值标本各多份，按常规方法测定，每份标本重复n次，记录结果。将所得结果进行统计学处理，即可得不同浓度下的精密度。,评价精密度时，低、中、高值标本必须分开进行测定，避免携带污染等因素的影响。举一反,三，用此计算方法可以评价仪器测定白细胞、血红蛋白、血小板等项目的精密度。批间精密度的评价也可用同一批号的标准参考粒子或同一批号的全血质控物标本，每天重复测定3次，连续测定10d或20d。同时，血细胞分析仪精密度的CV值，应在仪器说明书中允许的范围内。,2携带污染（carry-over） 携带污染是指不同浓度样品
41、间连续测定的相互影响，主要是高浓度样品对低浓度样品的污染。在这一指标正式评价前，先测定足够多的样品，以使血液分析仪处于稳定状态。然后，连续测定1份高值样品3次，记录为i1、i2、i3；随后立即连续测定1份低值样品3次，记录为j1、j2、j3。携带污染率越低，仪器此项性能越好，一般不得大于3。,3稀释效果（effect of dilution） 稀释效果是评价血液分析仪的测定值与稀释倍数是否成比例关系，借此试验可求出仪器的最佳线性范围。测定值与稀释倍数之间的线性范围应包括正常及常见的病理范围，且越大越好。,稀释效果测定一般应包括RBC、WBC、HGB、PLT四项，因此将不同浓度的血液稀释混合后，
42、各吸取0.1mL加生理盐水9.9mL，用以进行RBC和PLT测定；其余的血细胞悬液加入溶血剂，用以测定HGB和WBC。理想的结果是不同稀释程度的测定结果，在直角坐标纸上应是一条通过原点的直线。,4总重复性 用以评价血液分析仪总精密度（总重复性）的优劣，它包含随机误差和携带污染双重变异因素，受批内精密度、仪器校准、仪器漂移和携带污染的影响。总重复性的评价如果在较长时间内完成，样本的贮存和稳定也是重要影响因素。有时可对标本放置时间对重复性的影响单独评价。,5可比性（comparability） 指血液分析仪和常规应用方法所测结果的一致性。因此要评价新的细胞分析仪，将仪器测定结果与常规方法相比较。评
43、价时随机选择的样本例数应该较多，如果比较后无差别，即认为仪器法与常规法有可比性，反之则无。,6准确性（accuracy） 指测定结果与真值一致，真值必须是用决定方法或参考方法测定所得到的。血红蛋白可用ICSH推荐的参考方法。评价时，测定100份随机标本，将其结果与HiCN分光光度法所测结果进行比较，然后用配对t检验进行统计学处理。具体计算同评价可比性的计算方法相同。,7白细胞分类 （1）重复性：即观察同一份标本多次测定能否得到非常接近的结果。 （2）准确性：即与显微镜检查结果的相关程度。 （3）对病理细胞的测定：观察血液存在一定数量的异常细胞（特别是幼稚细胞）时，是否能从直方图反映出来。,二、
44、血细胞分析仪全面质量控制 血细胞分析仪是以大批量多参数检测临床标本，完全由仪器按事先设定的程序自动进行测试，因此要求必须具有高素质技术人员和建立严格的室内质量控制制度才能保证实验结果的准确性和精密度。,（一）分析前质量控制 1对技术人员的要求 技术人员上岗前应经过严格的岗前培训，仔细阅读说明书。要对仪器的原理、操作规程、使用的注意事项、细胞分布直方图及散点图的意义、异常报警的含义、引起实验误差的因素及仪器维护有充分的了解。掌握用NCCLS推荐方法校准仪器每个参数的程序。,2仪器安装条件 血细胞分析仪系精密电子仪器，为确保仪器的正常工作，安装时应注意：仪器安放在远离电磁干扰源、热源的位置。放置仪
45、器的实验台要稳固，工作环境要清洁。防潮、防阳光直射、通风条件好，室内温度应在1525，相对湿度应80。为了仪器安全和抗干扰，仪器应用电子稳压器并连接符合标准的专用地线。,3仪器的验收 新仪器安装后或每次维修后，必须对仪器的技术性能进行测试、校准、评价。这对保证质量有着非常重要的作用。,ICSH公布了对血细胞分析仪的评价方案，在对细胞计数和血红蛋白测定方面，要对仪器测试标本的总变异、携带污染率、线性范围、可比性、重复性、准确性进行评价。白细胞计数总变异应3，携带污染率2，重复性3，线性范围较宽。在电阻抗法白细胞分群时应注意细胞分类结果的符合性，与显微镜检查的相关程度及能否在直方图显示血液中存在一
46、定数量异常细胞等。,4仪器的校准 仪器验收合格后、仪器检修更换零件后及临床使用半年后，必须进行校准。仪器校准是保证检测结果准确的关键步骤，必须重视。校准时最好使用新鲜血作为校准物。,推荐采用间接溯源到国际标准的定值方法，一是在二级标准检测系统（即参考实验室）定值；二是在规范操作的检测系统定值，即使用配套试剂；用配套校准物定期进行仪器校准；规范地开展室内质控；参加室间质评成绩优良；人员经过培训。再按推荐的校准方法逐步地校准仪器。,5标本的采集和运送 血标本：全自动血细胞分析仪一般要求用抗凝的静脉血，尽可能不用外周血。因为外周血误差大、重复性较差，除非少数不易取静脉血者可用外周血，如婴儿、大面积烧
47、伤病人、放疗和化疗病人等。多项目同时采血时应取第一管作为血常规标本。,容器：采血时最好采用真空采血系统，易于标准化及质量控制，减少交叉感染。抗凝剂：采用不影响白细胞数量及大小、对红细胞形态影响小、可抑制血小板聚集的抗凝剂，ICSH推荐用EDTA-K2，含量为1.52.0mg/mL。,血液贮存：在室温下，EDTA-K2抗凝血的WBC、RBC、PLT可稳定6h，血红蛋白可稳定数天，白细胞形态可稳定2h（2h后粒细胞形态有变化，应先制备血涂片）。不能及时检查时，血液应室温保存。4条件下可延长血液贮存期，但应在8h内检查完毕。血小板不宜在低温下贮存，否则会影响PLT和MPV值。,6校准物和质控物 仪器
48、、配套试剂、配套校准物组成一个完整仪器标准检测系统（complete system，close system），它是保证检测质量和解决结果溯源问题的关键。血细胞分析仪的校准物为人血，它所标示的值只有在仪器的标准检测系统上使用，不能用不配套的试剂，更不能在不同厂家的仪器上使用。质控物是一种在保存期内较为稳定的人血，用它与病人样本一起分析，以控制外来误差，并了解仪器检测是否处于最佳状态。质控物所标记范围仅作参考，不能作为定值用。,7仪器参考值的设置 目前，国内对于仪器参考值的设置不甚协调，其来源也不一致。原则上各单位要根据自身的条件、仪器的型号，建立不同人群的参考值，每组至少40例，而且参考值经过若干年后应根据条件重新修订。,（二）分析中质量控制 血细胞分析仪在对血液样本进行分析时，要始终对仪器进行监控，确保仪器处于良好的工作状态，保证检验报告的可靠性。 1每天开机时的检查 开机后要检查仪器的电压、气压等各种指标在仪器自检后是否在规定范围内，试剂量是否充足，本底测试是否通过等。,2试剂及物理条件 血细胞分析仪的使用试剂一般分为稀释液、溶血剂和清洗剂，良好的试剂对保证仪器的正常运行和日常维护及获得准确的测试结果至关重要。最好使用仪器的原装配套试剂，以保证测试标本结果的质量和准确性，同时也保证仪器附件的正常使用和仪器寿命。血细胞仪计数最适温度为1822，15或30均对结果有影响。,
