1、实验 12 二苯胺法测定 DNA 含量一、目的学习和掌握测定 DNA 的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技术。二、原理脱氧核糖核酸中的 脱氧核糖在酸性环境中变成 羟基 酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在 595nm 处有最大的吸收，在每毫升含 DNA20400 微克范围内，光密度与 DNA 的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除 DNA 外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。DNA HO CH2C CH2 CHO 蓝色化合物酸性条件 二苯胺 O羟基 酮基戊醛三、材料、试剂和器具（一）试剂1、DNA 标准溶液：取小牛胸腺 DNA 用 0.1N 氢氧化钠溶液配制成
2、 200 微克/毫升的溶液。2、DNA 样品液：（自己提取）控制其 DNA 含量在 50100 微克/毫升左右。3、二苯胺试剂：称取 1 克结果的二苯胺试剂溶于 100 毫升分析纯的冰醋酸中，再加入 10 毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸 2.75 毫升，混匀备用。临用前加入 1 毫升 1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1，2，5 毫升）3、恒温水浴4、可见光分光光度计四、操作步骤（一）DNA 标准曲线的制作取 8 支试管，编号，按下表加入试剂管号 试剂 0 1 2 3 4 5 6 7DNA 标准液 0 0.
3、2 0.4 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0蒸馏水 2 18 1.6 1.2 1.0 0.8 0.4 0二苯胺试剂 4 4 4 4 4 4 4 4=加毕，摇匀，于 60恒温水浴中保温 1 小时， （或于沸水中煮沸 15 分钟，冷却测0.D595nm 值。 ）以光密度为纵坐标，DNA 含量（ug/ml）为横坐标，绘制标准曲线。（二）样品的测定取 2 支试管，各加 0.20.5 毫升的待测液（内含 DNA 应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至 2 毫升，再加 4 毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度 DNA 的含量，按下式
4、计算出样品中 DNA 的百分含量。DNA 含量 /毫升待测液=标准曲线查得值 稀释倍数 10)(/(%)6gDNA产 产 产 产 产 产 产产 产产 产产 产五、注意事项1、二茉胺法测定 DNA 含量灵敏度不高，待测样品中 DNA 含量低于 50mg/L 即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定 DNA 的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。2、样品中含有少量 RNA 并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰 DNA 定理。六、实验报告1、绘制标准曲线图2、计算 DNA 含量及产率七、思考题1、本实验的关键步骤是什么？如何控制？2、DNA 制品可用哪几种方法测定其含量，试从原理、准确性等方面加以比较。
