1、实验六 固定化 -淀粉酶及活性测定一、实验目的：学会交联法制备固定化酶的操作技术二、实验原理：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或 酶分子与载体间进行交联反应，以共价 键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用这种方法。交联剂为戊二醛， 载体为甲壳素。三、实验器材：1 恒温水浴锅2 恒温振摇仪四、实验试剂1. 5%戊二 醛2. 甲壳素3. 碘原液：称取碘 1.1g。碘化 钾 2.2g，置于小烧杯中，加 10ml 蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至 50ml。摇均后放于棕色试管中备用。
2、4. 比色稀碘液：取碘原液 2ml，加碘化钾 20g，再用蒸馏水定容至 5000ml。5. 2%淀粉溶液：称取 2g 可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至100ml。6. pH6 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na 2HPO4.12H2O）45.23g,柠檬酸（C 6H8O7.H2O）8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。7. 标准终点色溶液，A 液：精确称取氯化钴（CoCl.6H 2O）40.2493g 和重洛酸钾（K 2GrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至 500ml
3、.B 液:：精确称取络黑 T40mg，用蒸馏水定容至 100ml.同时取 A 液 40ml、B 液 5ml、混合后置于冰箱中待用。混合液在 15 天内使用有效。五、实验操作1. 酶 液的制 备 ：精确称取 -淀粉 酶 2g，先用少量 40pH6 的磷酸二 氢钠柠檬酸缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。将上 层液小心 倾入 100ml 容量瓶，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研 34 次。最后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容 摇匀后，通 过四层纱布过滤 ，溶液供 测定使用。2. 固定化 酶 的制 备(1) 称取 50mg 粉末甲壳素，加入 5%戊二醛 10ml，调节 p
4、H=8.5，搅拌均匀后，于25，恒温振摇 1 小时。取出后，倾去戊二醛，然后以蒸馏水洗涤，倾去清夜，以除去多余的交联剂。(2) 取前面制备的酶液 10ml，与上述 处理的甲壳素混合均匀，25，恒温振摇 1小时，然后 4冰箱放置过夜。(3) 取出后，4000rpm 离心分离，倾去清液，蒸馏水洗涤，可得固定化酶3. 固定化 -淀粉 酶 活力 测 定及活力回收率的 计 算（1）首先用吸管取 1ml 的标准终点色溶液，加至白瓷板的空穴内，作 为终点参照的标准。（2）固定前总酶活力测定：取 20ml 2%的可溶淀粉液与 5mLpH6 的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。将 试管置于 60水浴 5
5、 分钟。然后加入前面制备的酶液 0.5ml。摇匀后，立即用秒表记录时间 。此后，每 经一段时间，用吸管吸出 0.2ml 反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达终点时的时间。（3）固定化酶活力测定：取 20ml 2%的可溶淀粉液与 5mLpH6 的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。将 试管置于 60水浴 5 分钟。然后加入前面制备的固定化酶。摇匀后，立即用秒表记录时间。此后，不断振摇，每经一段时间，用吸管吸出 0.2ml 反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达终点时的时间。（4）酶活力计算：以 60、pH6 的条件下，每小时水解 1g 淀粉的酶量为一个活力单位。固定前原酶活力单位=60/T202%n/0.5固定后的酶活力单位=60/T202%n/10T：反应到终点时的时间（分）n：酶粉稀释的倍数(5) 固定化后 酶活力回收率计算：酶活力回收率=（固定后的酶活力单位/固定前原酶活力单位） 100%注意事项:测定酶制剂时，应先在 40水浴中悬浮 2 小时，再用纱布过滤。每次操作所用的纱布数要一致。
