1、实验十三 寄生虫实验诊断技术（医院见习）【目的】掌握粪便直接涂片法及饱和盐水浮聚法。熟悉血吸虫的病原诊断法和血清学诊断法。熟悉厚血膜涂片诊断丝虫或疟原虫感染。了解肛门周围查卵法。【实验内容】一、粪便检查【材料】载玻片、竹棒、滴管、平底玻管、生理盐水、饱和盐水。(一)粪便直接涂片法加一滴生理盐水(或清洁水)于洁净载玻片中部。用竹签挑取火柴头大小粪便一颗，在载玻片中部的液体中涂匀。涂片面积约为载玻片的 2/3，四周应留有空隙，厚薄以透过涂片看清印刷字体为宜。将涂片置于显微镜下观察，先用低倍镜，光线宜暗些，发现虫卵后，可转成高倍镜并调节光线与焦距，要按一定顺序移动，以免遗漏，并防止涂片干燥。详细观察
2、虫卵结构。粪便中常有许多与虫卵相似的杂质，如食物残渣、气泡、脂肪滴及细胞等，应注意鉴别。(二)饱和盐水浮聚法操作步骤:见图 21-1。图 21-1 饱和盐水浮聚法注意事项：粪便必须调匀，上浮粗渣要挑去。玻片必须洁净无油腻，放载玻片时，避免产生气泡。上提翻转载玻片时，要防止粪液落下。镜检时光线宜暗。镜检钩虫卵、蛔虫卵(受精、未受精)及鞭虫卵等。记录结果：1 个虫卵为“”，23 个为“”，4 个以上为“”（填图 21-1）。(三)吸取粪便沉渣制成玻片标本，镜检线虫虫卵和四种吸虫虫卵。(四)肛周检查蛲虫卵的方法【器材】载玻片、透明胶纸、剪刀、二甲苯、竹签、脱脂棉、漂浮杯、生理盐水、饱和盐水。透明胶纸
3、法 取文具店所售的透明胶纸卷，剪成 35cm 长的纸条，贴于载玻片上备用。检查时将此胶纸贴于受检者肛门周围皱壁上。粘贴数次，使胶纸面与肛门皱壁充分接触，然后揭下贴于原玻片上。镜检时，在胶纸下，载玻处滴加二甲苯 1 滴，可使胶纸平展，虫卵清晰，效果甚佳。棉拭子漂浮法 取一竹签，一端裹以脱脂棉，在生理盐水中稍加湿润，于受检者肛门皱壁上擦拭后的棉签放于漂浮杯内，加饱和盐水至 1/3 处，充分洗刷后迅速提起棉签，并在杯壁上挤去盐水；加饱和盐水至杯口，盖以载玻片，漂浮 1015min，取下载玻片镜检。观察结果填表 21-1。表 21-1 粪便检查虫卵姓名 性别 年龄方法 蛔虫卵 鞭虫卵 钩虫卵 血吸虫卵
4、 肺吸虫卵 姜片虫卵 其它粪便直接涂片法饱和盐水浮聚法沉淀孵化法其它检验者签名：日期： 年 月 日(五)钩蚴培养法。【材料】81.5cm 试管、滤纸、剪刀、阳性粪便。【步骤】将滤纸剪成与试管等宽但较试管较短的“T”形纸条；试管中加冷开水35ml；在滤纸条的中段均匀地涂上粪便约 3cm 长；将滤纸条插入试管，下端浸入水中但不触及水底；试管移入 2030温箱中培养。注意加水，勿使水干；35 天后观察结果。先摇动试管，用肉眼或放大镜检查，看水中有无乳白色，作蛇形活动的钩蚴。（六）鱼肉内囊蚴检查法直接压片检查法：剪取麦穗鱼背部肌肉，约绿豆粒大小，置两张玻片间压成薄片，置镜下顺序检查有无华支睾吸虫囊蚴。
5、消化检查法：将鱼分类后，剖开去除内脏，清洗，把鱼体剪碎(越碎越好)，或用研钵磨碎， 然后放入烧杯内，加入 10 倍的人工配制消化液(已由实验室配制好)，置于 37温箱中，每小时搅动一次。待完全消化后(46 小时)，用铜筛过滤，将过滤液静置沉淀 3040min，倒去上层液，再加入清水，如此再洗再次沉淀，每次 1015min。最后取其沉渣于小平皿内，在解剖镜下检查。 （七）沉淀孵化法操作方法见图 21-2。图 21-2 沉淀孵化法二、血液检查厚、薄血片制作及瑞特染色法(操作步骤见附图 21-4)。【材料】载玻片、三棱针、酒精棉球、染色缸、品蓝染液(或其它快速染液)。 （一）厚血片的制作（图 21-
6、3）（二）薄血片制作及染色(图 21-4)用 75酒精棉球消毒受检查者耳垂，待干后左手拇指与食指捏紧耳垂下方，并使 耳垂下方皮肤绷紧。右手持采血针，快速刺破皮肤，挤出血滴于洁净载玻片一端。取边缘平滑的另一载玻片作推片，左手持载玻片的两端，右手将推片的短边置于血滴上，使血液沿推片展开。使推片与载片成 3045 角，将推片向另一端推动，推成均匀的薄血片放置待干。 4、用蜡笔在血膜二边划一条线，目的是不使染液外流。用吸管吸取瑞特染液，滴 510 滴于血膜上。盖满全部血膜。1 分钟后(注意不使染液干燥)，加上等量的蒸馏水，染色 10 分钟，再以清水轻轻将染液冲去。血片斜置，待干后油镜检查，寻找疟原虫。
7、（三）厚薄血片混合制备法：具体操作完全同上二法，其区别是将二种制备法合并在一张载玻片上（图21-5）。图 21-3 厚血片制作法图 21-4 薄血片制备法图 21-5 厚薄血片混合制备法三、免疫诊断技术(一)环卵沉淀反应(COPT)环卵沉淀反应是诊断血吸虫病的一种免疫血清学试验，是抗原抗体的沉淀反应。抗原 采用血吸虫病后的肝脏，研碎后，离心沉淀收集虫卵。【方法】载玻片上滴加受试者血清二滴。用针头挑取日本血吸虫卵，约 100150 个，加入血清中混匀。覆盖 2434 毫米盖玻片，四周用石蜡密封，放 37温箱中，48 小时后用显微镜检查。【结果】判定虫卵外周出现泡状、指状或带状沉淀物(10 微米)
8、，累计面积小于虫卵面积的 12；或指状沉淀物，不超过虫卵的长径为阳性()；如虫卵外周泡状沉淀物面积大于虫卵面积，或指状沉淀物相当于或超过虫卵长径的 2 倍为强阳性()；如虫卵周围无沉淀物或泡状沉淀物小于 10 微米者为阴性()。还可根据环沉率(即 100 个虫卵中出现沉淀物的虫卵数)报告，环沉率5者为阳性；14者为弱阳性。粪检阳性的血吸虫病患者，环卵试验阳性率可达95。鲜卵环卵试验假阳性率为 1.9：干卵环卵试验假阳性率为2.53.6。在诊断血吸虫病时，除环卵沉淀反应外，还有尾蚴膜反应，其意义相仿。（二）酶联免疫吸附试验(见免疫学部分)【作业】1.记录直接涂片法、饱和盐水浮聚法检查粪便的结果。2.记录薄血片的制作与染色结果。3.记录免疫诊断方法的结果。【思考题】1.比较直接涂片法与饱和盐水浮聚法的优缺点。2.哪些寄生虫可以通过粪检方式诊断?哪些可采用活组织检查?哪些需采血检查?3.免疫诊断法的应用价值与病原诊断法有何异同?
