1、实验三 酵母 RNA 的提制（浓盐法）一、目的学习和掌握从酵母中提制 RNA 的原理和方法，以加深对核酸性质的认识。二、原理酵母含 RNA 2.6710.0，DNA 很少（0.030.516） ，而且菌体容易收集，RNA 也易于分离，所以选用酵母为实验材料。RNA 提制过程是先使 RNA 从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将 pH 调至 2.02.5，使 RNA 沉淀，进行离心收集。提取 RNA 的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者利用稀碱溶解细胞壁，使 RNA 释放出来，这种方法提取时间短，但 RNA 在此条件下不稳定，容
2、易分解；后者在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使 RNA 释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。三、仪器、试剂和材料1仪器（1）量筒（50ml）（2）三角瓶（100ml）（3）烧杯（250ml，50ml，10ml）（4）布氏漏斗（40mm）（5）吸滤瓶（125ml）（6）表面皿（6cm）（7）751 型分光光度计（8）离心机（4000rmin）（9）恒温水浴（10）药物天平（11）烘箱2试剂（l）NaCl（化学纯）（2）6molL HCI（3）95乙醇（化学纯）3材料鲜酵母或干酵母；pHO.55.0 的精密试纸。四、操作步骤1提取称取鲜酵母 159 或干酵母粉 2.5g，倒入 10
3、0ml 三角瓶中，加 NaCl 2.5g，水 25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取 lh。2分离将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以 4000rmin 离心 10min，使提取液与菌体残渣等分离。3沉淀 RNA将离心得到的上清液倾于 50ml 烧杯内，并置入放有冰块的 250ml 烧杯中冷却待冷至 10以下时，用 6molL HCI 小心地调节 pH 值至 2.02.5（注意严格控制 pH） 。调好后继续于冰水中静置 10min，使沉淀充分，颗粒变大。4洗涤和抽滤上述悬浮液以 4000rmin 离心 10min，得到 RNA 沉淀。将沉淀物放在 10ml 小烧杯内，用 95的乙醇 5
4、10ml 充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用 95乙醇 510ml 淋洗 3 次。5干燥从布氏漏斗上取下沉淀物，放在 6cm 表面皿上，铺成薄层，置于 80烘箱内干燥。将干燥后的 RNA 制品称重，存放于干燥器内。6含量测定将干燥后 RNA 产品配制成浓度为 1050pgml 的溶液，在 751 型分光光度计上测定其 260nm 处的吸光度，按下式计算 RNA 含量：式中，A 260 为 260nm 处的吸光度；L 为比色杯光径（cm） ；0.024 为 lml 溶液含 lgRNA 的吸光度。五、结果处理根据含量测定的结果按下式计算提取率六、注意事项1用浓盐法提取 RNA 时
5、应注意掌握温度，避免在 2027之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使 RNA 降解而降低提取率。2加热至 90100使蛋白质变性，破坏两类磷酸酯酶，有利于 RNA 的提取。七、思考题1沉淀 RNA 之前为什么要冷却上清液至 10以下？2为什么要将 pH 调至 2.02.5？参考文献文树基。主编基础生物化学实验指导西安：陕西科学技术出版社，1994西北农业大学主编基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1986袁玉苏，朱婉华，陈钧辉编生物化学实验北京：人民教育出版社，1979朱检，曹凯鸣，周 M 庞，蔡武城，袁厚积编著生物化学实验上海：上海科学技术出版社，1981
