1、实验十四 糖化酶活力的测定一、实验目的1、 学习糖化型淀粉酶(或液体曲 )酶活力的测定方法。2、 了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。二、实验原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。碘量法定糖原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。I2
2、2Na 2S2O3 = Na2S4O6 2NaI三、仪器、原料和试剂仪器吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、 碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。原料：AS3.4309 黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。试剂1. 2可溶性淀粉溶液：准确称取 2 克可溶性淀粉(预先于 100105烘干至恒重约 2 小时)，加少量蒸馏水调匀。倾入 80 毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至 100 毫升。2. 0.05 mol/L 碘液：称取 25 克碘化钾溶于少量水中，加入 12.7 克碘，溶解后定容至1000 毫升。3. pH4.5 的 1mol/L 醋酸缓冲液
3、：称取 8.204 克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至 1000 毫升。取分析纯冰醋酸 5.78 毫升定容至 1000 毫升。以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为 25：22 混合即为所要求之缓冲液。4. 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠 4 克溶解并定容至 1000 毫升。5. 1 mol/L 硫酸 ：吸取分析纯浓硫酸(比重 1.84)55.5 毫升，缓缓如入 944.5 毫升水定容至 1000 毫升。6. 0.01 mol/L 硫代硫酸钠：称取 26 克硫代硫酸钠(Na2S2O35H2O)和 0.4 克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至 1000 毫升，配制后放
4、置三天再标定。四、操作步骤1 糖化曲制备（以浅盘麸曲为例） （1）菌种的活化 无菌操作取原试管菌一环接入察氏培养基斜面，或用无菌水稀释法接种，31保温培养 47 天，取出，备用。 （2）三角瓶种曲培养 称取一定量的麸皮，加入 70%80%水，搅拌均匀，润料 1h，装瓶，料厚约1.01.5cm，包扎，在 9.8104Pa 压力下灭菌 40min。冷却后接种，3132培养，待瓶内麸皮已结成饼时，进行扣瓶，继续培养 34 天即成熟。要求成熟种曲孢子稠密、整齐。 （3）糖化曲制备a 配料 称取一定量的麸皮，加入 5%稻皮，加入原料量 70%水，搅拌均匀。b 蒸料 园气后蒸煮 4060min。时间过短，
5、料蒸不透对曲质量有影响；过长，麸皮易发粘。c 接种将蒸料冷却，打散结块，当料冷至 40时，接入 0.250.35%（按干料计）三角瓶种曲，搅拌均匀，将其平摊在灭过菌的瓷盘中，料厚约 12cm。（4）前期管理将接种好的料放入培养箱中培养，为防止水分蒸发过快，可在料面上覆盖灭菌纱布。这段时间为孢子膨胀发芽期，料醅不发热，控制温度 30左右。约 810h，孢子已发芽，开始蔓延菌丝，控制品温 3235。若温度过高，则水分蒸发过快，影响菌丝生长（5）中期管理这时菌丝生长旺盛，呼吸作用较强，放热量大，品温迅速上升。应控制品温不超过3537。（6）后期管理这阶段菌丝生长缓慢，故放出热量少，品温开始下降，应降
6、低湿度，提高培养温度，将品温提高到 3738，以利于水分排除。这是制曲很重要的排潮阶段，对酶的形成和成品曲的保存都很重要。出曲水分应控制在 25%以下。总培养时间约 24h 左右。（7） 糖化曲感官鉴定要求菌丝粗壮浓密，无干皮或“夹心”，没有怪味或酸味，曲呈米黄色，孢子尚未形成，有曲清香味，曲块结实。2. 糖化酶活力测定（1） 浸出液的制备称取 5.0g 固体曲（干重），置入 250ml 烧杯中，加 90ml 水和 10ml pH4.6 乙酸-乙酸钠缓冲液，摇匀，于 40水浴中保温 1h，每隔 15min 搅拌一次。用脱脂棉过滤，滤液为 5%固体曲浸出液。（2）糖化酶活力的测定取 2可溶性淀粉
7、溶液 25 毫升加 pH4.5 醋酸缓冲液 5 毫升混匀，在 40恒温水浴中预热 510 分钟加入待测酶液 2 毫升(空白以蒸馏水代替酶液 )准确计时 1 小时。取出加入 4滴 20NaOH 终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液 5 毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L 碘液 10 毫升，再加 0.1 mol/LNaOH 10 毫升，摇匀暗处静置 15 分钟。加入 2N硫酸 2 毫升。用 0.05 硫代硫酸钠滴定至无色。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在 46 之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。五、计算：A空白所消耗的 Na2S2O3 的毫升数；B样品所消耗的 Na2S2O3 的毫升数；90.051 毫升 1N 的 Na2S2O3 相当的葡萄糖毫克数；V1酶液的体积(2 毫升)；V2反应液总体积(32.20 豪升)；V3吸取反应液样品体积(5 毫升)；N酶液稀释倍数；NNa2S2O3 的当量浓度(0.01mol/L)。六、结果1. 记录制曲过程中观察到的现象。 2. 酶活力测定结果列表记录。七、思考题1. 固体曲和液体曲相比，各有何优缺点？2 糖化酶活力测定中应注意哪些因素？
