1、高效表达重组猪 IL10 的基因工程菌株的构建畜牧兽医,2003,34(4),385388ActaVeterinariaetZootechnicaSinica高效表达重组猪 IL.10 的基因工程菌株的构建仇华吉,金吉东,兰文升,郭海龙,周艳君,王云峰,童光志(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨150001)摘要:白细胞介素一 IO(ILlO)是一种 Th2 细胞等产生的能抑制 Thl 细胞释放细胞因子的免疫调节因子.从经脂多糖(LPS)活化的猪外周血单核细胞(PBMC)中提取总 RNA,用 RT.PCR 扩增了猪ILlO(polL-lO)编码基因,克隆并测序验证
2、后,将其亚克隆到表达载体 pPROEXxMHTb 中,转化 DH5a 后,用IPTG 诱导培养,经免疫印迹和生物活性检测显示,重组菌株表达了具有活性的重组 polL 一 10,重组 polL 一 10 表达水平达 3mg/ml 培养液,占菌体细胞总蛋白的 30.2%,本研究为 polL 一 10 的功能研究和临床应用奠定了基础.关键词:猪白细胞介素一 1O;重组 IL 一 10;抗炎细胞因子 ;基因表达中图分类号:Q81 文献标识码:A 文章编号:03666964(2003)04038504白细胞介素.10(Interleukin.10,IL.10)也称细胞因子合成抑制因子(Cytokines
3、ynthesisinhibitoryfactor,CSIF),B 细胞衍生的 T 细胞生长因子(Bcel1.derivedTcellgrowthfactor,BTCGF),是一种能抑制 Thl 细胞释放细胞因子的免疫调节因子,它主要由 Th2 细胞产生,Th0,Thl,单核/巨噬细胞,B 细胞等也可产生.IL10 下调 Thl 细胞和巨噬细胞的功能 .内脏型利什曼病特征是 IL.12 和 IFN.7 等细胞因子缺乏,用 IL.12 治疗可促进患者产生 IFN.7,而 IL.10则抑制这种反应(Bacellar 等,2000).在牛分枝杆菌感染小鼠模型中,IL.10 伴随 TNF 和 IL_12
4、 而产生,IL.10 缺陷小鼠细胞免疫增强,从而引起强烈的肉芽肿反应,使得细菌清除加快,表明内源性 lL10 削弱了免疫应答(Jambs 等,2000).在其它一些疾病中也发现在机体微环境中以 IL.10 为主,则会抑制机体保护性免疫反应(Faulkner 等,2000;Fortsch等,2000).IL.10 不仅直接抑制巨噬细胞表达 TNF.a 和IL,同时上调其它抗炎细胞因子(如 IL.IRa 和sTNF_RI)的表达,因而 IL10 具有抗炎作用,可抑制炎性反应的发生.在促炎细胞因子过量产生的疾病中,IL.10 起重要调节作用.胸膜肺炎放线杆菌引起严重的急性胸膜肺炎,伴随炎性细胞因子(
5、如IL.1,IL.6,IL.8 等)的表达增加,Morrison 等(2000)收疆日期:20030408基盒项目:国家重点基础研究发展规划项目(199011902)作誊筒介:仇华吉(1967 一),男,湖北广水人,副研究员,博士,从事动物病毒分子生物学与免疫学研究.*联系作者:童光志用重组腺病毒表达的猪 IL.IO(POIL-IO)治疗细菌性胸膜肺炎取得较好疗效,炎性细胞因子水平降低,感染猪肺部损伤大大减轻.为了大量获得廉价 poIL-lO,研究其免疫调节作用,我们通过 RT.PCR 从猪外周血单核细胞(PBMC)中扩增并克隆了 polL.10cDNA,利用原核系统进行了体外表达,获得了高表
6、达水平,具有生物活性的重组 polL.10.1 材料和方法1.1 质粒和受体菌克隆质粒 pUC18,大肠杆菌E.coliJM109 株和 DH5a 株由本室保存 ,表达质粒pPROEXTMHTb 由刘胜旺博士惠赠.1.2 引物根据 GenBank 发表的 polL.10 序列(GenBankaccessionNo.L20001),设计引物 P1 和P2,P1 序列为 5.TAGGATCCATGCCCAGCTCAGC-3,P2 序列为 5.GCAAGc1_rCAGTTCTTCCTC-3,分别在其 5 端引入 BamHI 和 Hindm位点.1.3 总 RNA 提取取一头 3 周龄仔猪,从前腔静脉
7、无菌采集抗凝血,用淋巴细胞分离液分离 PBMC,然后用 RPMI1640 完全培养基(含 10%胎牛血清和适量抗生素)中培养 0.5h,然后加入 LPS(Sigma 公司)继续培养 5h(Dozois 等,1997). 收集细胞培养物用 TRIml 试剂(GIBCOBRL 公司)按厂商提供的方法提取总 RNA.1.4RT-PCR 扩增取总 RNA30ng,加入适量Oligo(dT),dNTP,10buffer(RAV),RNasin,AMV反转录酶(TaKaRa 公司),42作用 1h,获得 cD-386 畜牧兽医 34 卷NA,94加热 5min 以灭活反转录酶.取上述 cDNA5l 加入适
8、量引物 P1 和 P2,dNTP,10buffer,ExTaqDNA 聚合酶(TaKaRa 公司)进行 PCR 扩增,反应条件为 95预加热 5min;941min.541min,72Imin,30 个循环;72延伸 10min.扩增结束后取 5lPCR 产物,用 2%琼脂糖凝胶进行电泳分析.1.5 分子克隆及序列测定用 BamHI/HindHI双酶切 PCR 产物,回收纯化目的片段后用 T4DNA连接酶将其插入 pUC18 质粒的 BamHI/HindHI位点,取连接产物转化 JM109 感受态细胞,涂布于含有氨苄青霉素的 LB 平板,挑取单个菌落振荡培养,以小量法提取质粒,分别用 PCR
9、及 EcoRV 或BamHI/HindHI 酶切进行鉴定 ,然后进行序列测定.测序验证后将 polL 一 10 基因亚克隆至表达载体pRROEXTMHTb 的 BamHI/HindIn 位点,转化DH5a 感受态细胞 ,同上提取质粒用酶切和 PCR 初步鉴定,最后测序验证阅读框架的正确性.1.6 诱导培养从转化插入 polL 一 10 的重组质粒的 HD5a 菌株平板中挑取单个菌落,加入含 100/.tg/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中,置于 37下剧烈震荡培养至 A59on0.51.0 时,加入终浓度为 0.51mmol/L 的 IPTG(Gibeo 公司 )诱导培养 26h(Marti
10、nez-Torrecuadrada 等,1995),取样的待检.1.7SDS.PAGE 分析取上述重组细菌诱导培养物,离心除去上清,用 PBS 洗涤细胞沉淀 2 次,再用PBS 重悬沉淀,冻融 2 次,经超声波裂解处理后 ,加2上样缓冲液100mmol/LTrisc1(pH6.8),200mmol/L 二硫苏糖醇,4%(W/,)SDS,0.2%(w/v)溴酚蓝,20%(V/,)甘油煮沸 5min,按已介绍的方法(Sambrook 等,1989)用 5%SDS-PAGE 进行分析,电泳完毕后将凝胶用考马斯亮蓝染色,同时用薄层扫描仪分析目的蛋白的相对含量.按照 pPROEXTMHT 载体操作手册介
11、绍的方法分别提取培养物上清,菌体周质,胞浆,包涵体,进行表达区室定位分析.1.8Westernblotting 分析用上述方法电泳后.用电转化法将凝胶转印至硝酸纤维膜上,用组氨酸标签检测试剂盒 HisTagApWesternReagents(Novagen 公司)按厂家说明书进行 Westernblotting 检测.1.9 重组 0oil-10 活性测定提取重组细菌的包涵体成分,经超声波裂解处理后,测定蛋白浓度,用RPMI1640 培养基将待测样品稀释成 100,10,10.,10 一,10,10gl,用同样方法处理转化载体 pPROEXHTb 的 DH5a 菌株培养物,作为对照样品,用于测
12、定 polL 一 10 活性.根据 Yoon 等(1992)介绍的方法制备猪肺泡巨噬细胞,在 24 孔培养板中每孔加入 610 个细胞,用含 10%胎牛血清和适量抗生素的 RPMI1640 营养液培养 5h 后,分别加入 100tA 不同稀释度的待测样品和对照样品,再加终浓度为 10g/ml 的 ConA(AmershamPharmaeia 公司 ).在 37含 5%a 二)2 的饱和水气二氧化碳培养箱中培养 24h.收集细胞培养物提取总 RNA,用已建立的定量 RT-PCR 检测的 IFN 一 7mRNA(郭海龙等,2001),所用竞争模板是 IFN 一基因的部分片段,引物为 5 一 G1v
13、r1v 丌 CTGGCTC1vrACTGD3 和 5 一 CTTCCGCTTTCTTAG(v】_AG-3.根据测定的数值,绘制竞争曲线,判定样品中 IFN 一 7 含量,由此确定 IL 一 10 活性.1U 定义为能抑制 50%最大 IFN 一 7 产生的含量.2 结果2.1polL-lO 的扩增和克隆从 LPS 诱导培养 5h的猪 PBMC 中分离总 RNA,运用 RT-PCR 扩增得到 540bp 左右的特异性片段,PCR 产物经 EcoRV酶切,得到大约为 250bp 和 300bp 两条带,与预期结果相符.将 PCR 产物用 BamHI 和 HindHI 双酶切后回收,连接到同样处理的
14、 pUC18 质粒中.应用特异性引物进行 PCR 鉴定,同时用 BamHI 和HindIn 进行双酶切鉴定,证实目的片段已插入载体中,重组质粒命名为 pUt-ILl0.对 pUC-ILl0 插入片段测序结果显示 ,其中含有完整的 POlL-10 基因,其开放阅读框架由 528 个核苷酸组成,编码 175 个氨基酸残基,含有 1 个糖基化位点,与 GenBank 发表的 POlLol0 基因序列(Gen.BankaccessionNo.L20001)完全一致.表明 polL 一 10基因是比较保守的.序列比较表明,polL-10 基因与人 IL.10 基因 (GenBankaccessionNo
15、.NM000572),大鼠 IL.10 基因(GenBankaccessionNo.NM012854)和小鼠 IL.10 基因 (GenBankaccessionNo.NM010548)核苷酸同源性分别为 84%,79%和79%,氨基酸同源性分别为 75%,70%和 70%,与爱泼斯坦一巴尔病毒(EBV)IL 一 10 样基因 BCRF1(编码vlL-lO)同源性为 67%,polL.10 与人 IL-10 基因序列的同源性很高,这与两种动物的 IL-10 具有交叉4 期仇华吉等:高效表达重组猪 IL-10 的基因工程菌株的构建 387反应活性是一致的(Blancho 等,1995).随后将
16、polL.10 基因亚克隆至 pPROEXmHTb的 BamHI/Hind位点,经酶切和 PCR 鉴定证实表达质粒插入目的基因,命名为 pHTb.ILl0,测序结果表明,polL.10 基因恰好与表达载体中的起始密码子处于一致的阅读框架(in.frame),因此目的基因将以组氨酸标签(His.tagged)融合蛋白的形成表达.2.2 重组 pol1.10 的表达与活性转化 pHTb.ILl0 的重组 DH5a 菌株经诱导培养后,插入的目的基因得到高效表达,表达的重组蛋白表观分子量约为 22kd,经过优化选择,以诱导前 A590=0.7,0.8mmol/LIPTG 诱导培养 4h 表达水平为最大
17、,重组1图 1 表达重组 polL-10 菌株的8-PAGE 分析1.分子量 M/uker2.转化 plm,1O 菌株包涵体3.转化 pHTb-IL10 菌株菌体 4.peROEXHIb 转化 DH5a 菌株3 讨论IL.10 是一种重要的细胞因子,具有多种生物学功能,在免疫网络调节中发挥独特的作用.例如它可抑制巨噬细胞产生细胞因子,抑制巨噬细胞的抗原提呈功能;促进单核/巨噬细胞表达 IL.1Ra,因而具有抗炎作用;可刺激 B 细胞的分化,上调其MHG类分子表达和抗体产生;抑制 Thl 细胞介导的细胞免疫应答,抑制 Thl 细胞产生 IL.12,从而间接抑制 NK 细胞活性,等.感染和疾病的消
18、除取决于在促炎应答和抗炎应答之间达成某种平衡.IL.10 对疾病的严重程度和最终结果的影响可能取决于病原类型和宿主种类.例如在小鼠模型中,IL.10 对不同细菌性胸膜肺炎的治疗效果可能存在差异(Sawa,1997;Standiford,1999;VanderP0ll,1996).不同病原与宿主之间的蛋白可占菌体总蛋白的 30.2%左右,相当于 3mg/ml 培养液.分别对重组菌株的不同组分进行 SDPAGE 分析,结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在(图 1),通过提取包涵体制备的重组 polL.10 粗提物纯度可达 80%.Westernblotting 试验证实重组蛋白可被组氨酸特异性单抗
19、所识别(图 2),表明重组蛋白以带有组氨酸标签的融合蛋白形式表达,因此重组蛋白表观分子量(22kd) 比天然蛋白(18kd) 略大.生物学活性检测结果表明,重组 polL.10 能特异性地抑制 ConA 刺激猪肺泡巨噬细胞产生 IFN 一,活性相当于 10U/mg.123图 2 重组 polL-10 的 Westemablot 分析1.分子量 Mark 口 2.转化 plm,lO 菌株3.pf3DHrb 转化 DI5a 菌株相互作用的差异可能影响 IL.10 的治疗效果(Moore1998).本研究构建的高效表达 polL.10 的基因工程菌株,对于研究 polL.10 在猪各种疾病中的免疫调
20、节作用,以及开发治疗免疫功能紊乱的免疫调解剂及某些炎性疾病的抗炎防治剂,无疑具有很大的应用价值.选择一种合适的表达系统对于外源基因的高效表达至为关键,我们曾用 pET 表达系统对 polL.10基因进行了反复表达尝试,但未能获得成功(结果未显示),这可能是由于该基因的独特性不适合于在该体系中表达.为了获得目的蛋白的高效表达.需要对影响表达的各种参数(高表达菌株的筛选,诱导培养前细菌生长状况,诱导荆浓度,诱导时间等)进行优化选择,经过反复摸索,最终确定诱导前 A590=0.7,0.8mmol/LIPTG(终浓度)诱导 4h 比较理想.本研究构建的表达重组 polL.10 的基因工程菌畜牧兽医 3
21、4 卷株培养方法简单,生长迅速,可发酵培养,所获得的重组 POIL 一 10 产量高,纯化工艺简捷,成本低廉,活性强,因此具有良好的开发应用前景.参考文献:1BacdlarO,DoliveiraAJr,JeronimoS,eta1.IL-10andIL-12arethemainregulatorycytokinesinvisceralleishmaniasisJ.Cytokine,2000,12(8):12281231.2BlanchoG,GianelloP,GermanaS,eta1.Molecularidentificationofpordneinterleukin 一 10:regula
22、tionofexpressioninakidneyallograftmodelJ.ProcNatlAcadSciU.S.A.,1995,92(7):28002804.3DozoisCM,OswaldE,GautierN,eta1.Areversetranscrption-polymerasechainreactionmethodtoanalyzeporcinecytokinegeneexpressionJ.VetImmunolImmunopathol,1997,58(34):287300.4FaulknerL,BuchanG,BairdM.Interleukin-10doesnotaffect
23、phagocytoais0fparticulateantigenbybonemarrow-deriveddendriticcellsbutdoesimpairantigenpresentationJ.Immunology,2000,99(4):523531.5FortschD,RollinghoffM,StengerS.IL 一 10convertshumandendriticcellsintomacrophage-likecellswithincrestedantibacterialactivityagainstvirulentMycobacteriumtuberculosisJ.JImmu
24、nol,2000,165(2):978987.6HawkinsDL,MacKayRJ,MacKaySLD,eta1.Humaninterleukin-10suppressesproductionofinflammatorymediatombyLPSstimulatedequineperitonealmacrophagesJ.VetImmunolImmunopathol,1998,66:110.7JacobsM,BrownN,AIlieN,eta1.Increasedresistancetomycobacterialinfectionintheabsenceofinterleukin-10J.I
25、mmunology,2000,100(4):494501.8Martinez-TorrecuadradaJL,CasalJI.IdentificationofalinearneutralizationdomainintheproteinVP2ofAfricanhomesicknessvirusJ.Virology,1995,210:391399.9MooreTA,StandifordTJ.Theroleofcytokinesinbac.terialpneumonia:aninflammatorybalancingactC.ProcAssocAmPhysicians,1998,110(4):29
26、7305.10MorrisonDF,FossDL,MurtaughMP.Interleukin-10genetherapy-mediatedameliorationofbacterialpneumoniaJ.InfectImmun,2000,68(8):4752-4758.11SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.Molecularcloning:alaboratorymanualM,2 耐 ed,ColdSpringHarborLaboratoryPress.1989.12SawaT,CorryDB,GropperMA,eta1.IL 一 10improveslungi
27、n)uryandsurvivalinPseudomonasaerugirlosapneumoniaJ.JImmunol,1997,159(6):2858-2866.13StandifordTJ,WilowskiJM,SisaonTH,eta1.Intrapulmonarytumornecrosisfactorgenetherapyincreasesbacterialclearenceandsurvivalinroutinegram-negativepneumoniaJ.HumlleTher,1999,10:899909.14vanderPoll,MarehantTA,KenghCV,eta1.Inerleukin-10impairshostddenseinroutinepnemnococcalpnemoniaJ.JIt,ActDis,1996,147:9941000.
