1、总 RNA 提取常见问题分析Q：RNA 降解 A：1. 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如 果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。 2. 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免 RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。3. 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA 也比新鲜
2、样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。4. 外源 RNA 酶的污染：试剂，器械及实验环境中的 RNA 酶进入实验系统。5. 内源 RNA 酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。Q：OD260/OD280 比值偏低A：1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得 RNA 的 OD260/OD280 比值偏低，则用氯仿重新
3、抽提一次，再沉淀，溶解。2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致 OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取 RNA 时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。4.设备限制：测定 OD260 及 OD280 数值时，要使 OD260 读数在 0.1-0.5 之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 OD 值时，对照及样品稀释液请使用 10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。Q：RNA 提取得率低A：1. 该组织或者细胞中 RNA
4、 含量偏低：不同细胞和组织中 RNA 的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总 RNA 含量 2-4g/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总 RNA 含量 0.05-2g/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总 RNA 含量0.05g/mg)。2. 组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中 RNA 含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致 RNA 得率低。质粒 DNA 提取常见问题分析Q: 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？A: 1. 大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。2. 质粒拷贝数低：由于使用低
5、拷贝数载体引起的质粒 DNA 提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3. 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。4. 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液 P1、P2 和 P3 的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液 P1、P2 和 P3，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。5. 溶液使用不当：溶液 P2、P3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于 37保
6、温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。6. 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如 TB 或 2YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少 LB 培养液体积。7. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。8. 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。9. 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。10. 洗脱液不合适：DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液 EB(10
7、mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于 pH 值，最大洗脱效率在 pH7.0-8.5 间。当用水洗脱时确保其 pH 值在此范围内，如果 pH 过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至 60后使用，有利于提高洗脱效率。11. 洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。12. 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置 1 分钟可达到较好的效果。Q: 质粒纯度不高，如何解决？A: 1. 混有蛋白：不要使用过多菌体。经溶液 P1、P2、P3 处理
8、，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。2. 混有 RNA：RNaseA 处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液 P3 之后室温放置一段时间。如果溶液 P1已保存 6 个月以上，请在溶液 P1 中添加 RNaseA。3. 混有基因组 DNA：加入溶液 P2 和 P3 后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组 DNA 剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液 P2 后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和 DNA 的降解，培养时间不要超过 16 小时。4. P3 溶液加入时间过长：P3 溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会
9、产生小片段 DNA 污染。5. 含大量核酸酶的宿主菌：宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒 DNA，影响提取质粒 DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如 DH5 和 Top10。6. 质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。DNA 片段纯化与回收常见问题分析Q：利用凝胶回收试剂盒 DNA 回收效率较低或者未回收到目的片段？A：可能有以下几个原因：1. 胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；2. 胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；3. 电泳缓冲液 pH 太高，硅基质
10、膜在高盐低 pH 结合 DNA，如 pH 太高，应作适当调整；4. 漂洗液中未加入无水乙醇。Q：能否改用去离子水洗脱？A：可以。但是实验室所用纯水一般 pH 偏低，可利用 NaOH 适当调高其 pH 值，以增加洗脱得率。Q：回收 DNA 进行后续酶切实验？A：洗脱产物含有残留的乙醇会影响酶切，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。Q：可否使用更小洗脱体积(小于说明书提供的最小洗脱体积)进行洗脱以提高浓度？A：不可以。因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将 DNA完全洗脱下来。Q：电泳检测只有一条目的带，可否选用凝胶回收试剂盒？A：可以
11、。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。Q：琼脂糖凝胶胶块不溶？A：1. 琼脂糖质量不好。2. 含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在 4或-20。3. 制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。另外有两个有趣的现象：在水中测定 A260/A280，比值将变低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中测定的比值比在 1mM EDTA 中测定的高 0.2 左右。这两点也是要注意的，所以当我们用 DEPC 处理过的水溶解 RNA 并测定其 260/280 比值的时候，往往都是小于 2.0 的。
