1、甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌的基因分型研究物学和免疫学杂志 2OO6 年 3 月第 26 卷第 3j 强婴 !蛩:甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌的基因分型研究祁美英戴二黑周冬生崔百忠金丽霞戴瑞霞赵海红李存香杨晓艳于晓涛吴得强唐永姣李敏杨瑞馥【摘要】目的研究我国甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌的基因分型.方法根据已经证实的 22 个 DFR(差异区段)设计引物,每株鼠疫菌的每个 DFR 都采用PCR 技术进行验证.结果 17 株甘宁黄土高原疫源地鼠疫菌株共包括 3 个基因型,即 7,ll 和 13 型.7,ll和 13 型所占比例分别为 5.9%(1/17),5.9%(1
2、/17)和 88.2%(15/17).结论我国甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌的基因型主要为 13 型,而且 13 型是该疫源地鼠疫菌所特有的基因型.【关键词】鼠疫耶尔森菌;PC,R;基因组;差异区段;自然疫源地G 矗嘲 mic 姆衄 ofslraimofY.pcstfrom 豫啊蜘,-icuaalaschanicusnFocusof 恤LoessEteaninGeasaandNmgdaprovincesQ,Er-hei,Dong-d,ng,CUI,JINLi-xia,DAIRui-xia,ZHAOhai-hong,LIQ 盼咖,Xiao-yan,YUXiao-tao,WUDe-qian
3、g,Yong-jian,LIMin,.Provincalh,tiforEndemicDiseaseandControl,Xining8ll602.ChinaC 酷曲蟹 author:LIMin,Email:qhedpcpublic.勰.qh.m【Ab 曲 md】0bjGenomic0f17stdnsofY.ne 丌瑚灿咖 mdln, 妇岱PlagueFocus0ftl】LoessPheauinC4ISUandNiIlprovinceswerea 】dvzedin0】d 盯toshldrtl】翻既 cdi.vt)r0fY.pes6.MeflmdsPlpairstarg 她tIle22DFRswe
4、redesiledfordewingtIlegenomictype8intl】8traf0lII5j 秆,l0i 矗岱 d 咐clmndI,|l 珊 PlagueFocus0ftl】LoessPLeauinC4ISUandNingaPOV./rices.RegultThreetyp 瞄0fgenomovarin17strains0fY.pBwereidenfifiedasgencvar7,11and13.Ihedistributionofgenomovar7,lland13was5.9%(1/17),5.9%(1/17)and88.2%(15/17),respectively.(j 口啊 dm
5、TllemainandspecificgenomictypeinstrainsofY.pBs 疵 born5;咖 i 矗 d 口lrl 口 a/asdum/cusPlagueFocus0ftheLoessPlateauinGansuandNinesprovincesisgenomovar13.【Keywords】 Yers/n/apB;P(;Genomics;DFR;NaturallgUefocus甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地位于我国温带黄土高原山地丘陵草原.阿拉善黄鼠为该疫源地的主要宿主,主要寄生蚤为方形黄鼠蚤蒙古亚种.纪树立将该疫源地的鼠疫菌分为黄土高原 A型和黄土高原 B 型【2】.
6、我们采用 PCR 技术对分离自该疫源地的 l7 株鼠疫菌进行了基因分型研究.材料和方法实验菌株:实验所用 l7 株鼠疫菌由青海鼠疫耶尔森菌菌株保藏中心提供(见表 1),除宁夏海原的作者单位:811602 西宁,青海省地方病预防控制所(祁美英 ,崔百忠,金丽霞,戴瑞霞,赵海红,李存香,杨晓艳,于晓涛,李敏);100071军事医学科学院微生物流行病研究所(戴二黑,周冬生,杨瑞馥);甘肃省地方病预防控制所(吴得强,唐永姣)通讯作者:李敏,F./uail*忡public.m.曲.m,电话:0971.82I 西(.细菌学124001 株,甘肃天祝 13(DO1 株和会宁 74014 株为古典型外,其他
7、l4 株鼠疫菌均为中世纪型.鼠疫菌DNA 提取参照文献3.裹 1 实验用菌株Table1.Selectedstralas引物设计和 PCR 扩增方法:在周冬生等 鉴定的 22 个 DFR 中,有 3 个位于 pMTI 质粒中,l9 个位于染色体上.采用 A 翊 De 嘶 ler2.0 软件针对每ChinJMicrdaiolhlmnd.March2OO6,Vol26,No.3个 DFR 各设计一对引物,为了证实 pMT1 的存在,我们还特意针对 pMT1 质粒设计了一对引物,引物序列见表 2.PCR 反应体系:10 buffer2.5ml,10mmoFLdlWP0.25ml,5U/mlTaqDN
8、A 聚合酶 0.2IIll,10mmol/L 引物对 0.5ml,5ng,IIll 模板 DNA2ml,用去离子水补足至 25ml.PCR 扩增条件:95预变性 3min,按 9430s,6030s,7260s 扩增 30个循环,72C 延伸 5min.PCR 产物检测:PCR 产物在 1% 2%的琼脂糖凝胶上电泳,紫外分析仪下观察结果,在预计相对分子质量处存在条带者为阳性.每次 PCR 检测均设阴性对照( 用去离子水取代模板)和阳性对照( 模板为鼠疫菌菌株 91001 和 82009DNA 的混合物,包括全部 22 个 DFR).可疑 PCR 结果和阴性 PCR 结果至少重复一次.结果1.P
9、CR 扩增的特异性:为了验证 PCR 扩增的特异性,每对引物的 PCR 扩增产物与相对分子质量标志物同时在琼脂糖凝胶上电泳,均在预计相对分子质量处出现条带,说明 PCR 扩增结果正确.2.甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌的基因分型(表 2):参照周冬生等人的分型标准 H】,甘宁黄土高原疫源地 17 株鼠疫菌可以分为 3个基因型:7 型,11 型,13 型.裹 222 个 DFR 在甘宁黄土高原疫源地鼠疫菌中的分布状态鼬 2.Dimilmta0f22DFRs0fY.fromPlagueFocus0fC,amuandNlngmM 岫咀 iII(h 童曩DFROl020304060708o9l
10、Ol1l2l3l4l5l6l7l8l92o2l22+:praaent;一:ddeed3.甘宁黄土高原疫源地中各县鼠疫菌的 DFR分布状况:见表 3.裹 3 甘宁黄土高原疫源地中各县鼠疫菌的 DFR 分布状况Tal/le3.DimCaltkm 舶_fDtsfromCOOl1ilIG 柚鳓 andNmg:daMouaialmPlagueFocusCountry1 删HuiningJingyamTlamhuQHaiyuan)【iii讨论采用 PCR 技术对周冬生等发现的 22 个 DFR 进行扩增,甘宁黄土高原疫源地鼠疫菌株共包括 3 个基因型,即 7,1l 和 13 型.7,11 和 13 型所占
11、比例分别为 5.9%(1/17),5.9%(1/17)和 88.2%(15117),说明该疫源地鼠疫菌株的基因型以 13 型为主.纪树立将该疫源地鼠疫菌分为两个生态型,即黄土高原A 型(宁夏的固原,海原,西吉和甘肃的靖远)和黄土高原 B 型(甘肃的会宁)】.但基因分型结果显示,除 1 株甘肃会宁鼠疫菌为 7 型外,甘肃会宁鼠疫菌的基因型与甘宁黄土高原疫源地其他县菌株的基因型并无明显区别,均为 13 型.但不同地域的主要宿主种类不同,鼠疫耶尔森菌基因组型也不同,凡是分离自阿拉善黄鼠的鼠疫耶尔森菌均被归为 13 型,而分离自长爪沙鼠的菌株均被归为 1l 型,这两种基因组型的差异还在于 DFR8 上
12、,DFR8 包含的基因CO92 一 880989,产物为膜蛋白,在 1l 型基因组中存在该 DFR8,而 l3 型基因组中缺失该 DFR8.我国存在 11 个鼠疫疫源地,通过对除呼伦贝尔高原蒙古旱獭鼠疫自然疫源地(该疫源地没有菌株)外的10 个疫源地 639 株鼠疫菌基因分型研究,发现 13 型为甘宁黄土高原疫源地鼠疫菌特有的基因型.因此,根据基因分型可以判断传染源,为鼠疫的防治和防止生物恐怖提供可靠的实验室依据.参考文献1 方喜业,主编.中国鼠疫自然疫源地.北京:人民卫生出版社 ,1990,77-93.2 纪树立,张海峻,刘云鹏,等.中国鼠疫菌分型及其生态学流行病学意义.中华流行病学杂志,1990,儿(特刊 1 号):60-66.3AehananM,ZurthK,MordliG,da1.Ye./m,thecausc0fpl 阳 le,isavacenflydane0fYers/n/madoaderadm/s.ProcNailAeadSciUSA,1999,96:14043?14048.4 周冬生,韩延平,宋亚军,等.鼠疫耶尔森氏菌基因组进化与生态位适应研究.解放军医学杂志,2OO4,29(3):204-210.(收稿日期:20Q54-04)+一+一一+一一+一+一+一一一7l3llll5l
