1、骨髓间充质干细胞在心肌梗死区的移植和分化对心肌梗死后心力衰竭的影响?l38?心脏杂志(ChinHeartJ)2006,t8(2)骨髓间充质干细胞在心肌梗死区的移植和分化对心肌梗死后心力衰竭的影响徐瑾,王彬尧,王长谦,何奔,陈颖敏,李慧丽(上海第二医科大学附属仁济医院心内科,上海 2oooo1)摘要:目的采用 2 脱氧 5 一氮杂胞苷(5-azaCdR) 诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)移植于心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌中,评价其存活,分化及对心功能的影响.方法将经 5-azaCdR(0.3ixmol/L)两次诱导,溴氮胞苷标记的第 2 代大鼠 MSCs 植入心肌梗死后 l0d 心力衰竭大鼠心肌
2、疤痕中,同时以植入无血清培养基(DMEM)的大鼠为对照.移植前及移植后 1 月,通过检测左室射血分数(LVEF)等超声指标研究其对心功能的影响;应用双重免疫组化及电镜观察研究 MSCs 在心肌梗死区的存活和分化.结果移植后 1 月,MSCs 组大鼠心功能LVEF=(834-8)%,l=13较 DMEM 组LVEF=(474-12)%,l=12显着改善(P0.01);并且较移植前LVEF=(64 10)%,l=13也有显着提高(P0.01). 移植的 MSCs 能在心肌及疤痕中存活,并向心肌细胞分化,TmponinT 及 Connexin43 阳性.MSCs 有肌丝形成 ,并与周围心肌细胞紧密连
3、接,类似闰盘.结论经 5-azaCdR 诱导的 MSCs 移植后 1月,能在心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌及疤痕中存活并向心肌细胞分化,且可改善大鼠的心功能.关键词:骨髓间充质干细胞;细胞移植;心力衰竭中图分类号:R541.61;R459.9 文献标识码:A 文章编号:1009-7236(2006)02-138-05Effectofmesenchymaistemcelltransplantationanddifferentiationininfractedmyocardiumoninfarction-inducedheartfailureinratsXU 凡,WANGBin-yao,WANGCha
4、ng-qian,HEBen,CHENYing-min,LIHuili(DepartmentofCardiology,RenjiHospital,ShanghaiSecondMedicalUniversity,Shanghai200001,China)Abstract:AT0investigatethesurvivalanddifferentiationof5.aga-2.deoxycytidine(5.aza.CdR)inducedmesenchymalstemcells(MSCs)ininfractedmyocardiumandtheireffectoninfaretion.inducedh
5、eartfailureinrats.METHoDSTwo-passagedratMSCs,inducedtwiceby5-aza-CdR(0.3p,mol/L)andlabeledbybromodeoxyuridine.weretransplantedintotheventricutatScartissuesofratsinthemodelofinfarctioninducedheartfailure.Theratsreceivingserumfreemedium(DMEM)inieetionwereusedascontrols.0Bemonthaftertransplantation,the
6、parametersofheartfunction,suchasejectionfraction(LVEF),wereexaminedbyechocardiographyandthesurvivalanddifferentiationofthetransplantedMSCswereobservedbydoublelableimmunohistochemistryandelectronicmicroscope.RESULTSOnemonthaftertransplantation,theEFvalueofMSCsgroupLVEF=(834-8)%,n=13increasedsignifi.c
7、antlycomparedtothatofDMEMgroupLVEF=(4712)%,n=12,P0.01andimprovedcorn.paredtothatbeforetransplantationLVEF=(6410)%,n:13,P0.01.rhetransplantedcellssurvivedinmyocardialscaranddifferentiatedintoeardiomyoeyteswithpositiveTroponinTandConnexin43.MusclesilksformedindonorMSCsandtheMSCsconnectedwithnativecard
8、iomyocytescornpactlvlikeintercalateddisks.CoNCLUSloNOnemonthaftertransplantation.5.aza.CdRinducedMSCscansurviveintheinfractedscarofratsandpossesssomecharactersofeardiomyoeytes.The5.aza-CdRin-基金项目:上海市自然科学基金项目资助(No.02ZB14038)作者简介:徐瑾,主治医师,博士 Tel:63260930-2324Email:心脏杂志(ChinHeartJ)2006,l8(2)?l39?ducedMS
9、Csimprovetheheanfunctionofinfarctioninducedheanfailureinrats?Keywords:mesenchymalstemcells;celltransplantation;heanfailure冠心病急性心肌梗死后,心肌细胞死亡丢失及低灌注造成心肌细胞冬眠,使梗死区心肌丧失舒缩功能,促发心力衰竭(HF);心室重构进一步加重心功能恶化.血运重建术可恢复部分冬眠心肌功能,但对丧失的心肌细胞及微循环侧支无生成能力.细胞移植可提供心肌梗死(MI)后 HF 治疗新策略.血管源性细胞移植可能参与新血管生成,利于微循环改善,挽救冬眠心肌;肌源性细胞移植可能稳
10、固疤痕,赋予弹性,防止梗死区变薄,心室重构及心功能恶化.骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞,离体在 5 一氮杂胞苷类(5-Azacytidine,5-azaCR)物质诱导培养下或在心肌中可向心肌细胞分化,而在 MI 疤痕中则向成纤维细胞演变.但另有报道 MSCs 未经过 5-azaCR 诱导在心肌疤痕中也能向心肌细胞分化,肌浆球蛋白重链及肌钙蛋白 I 阳性 ,但移植并不改善心功能.而经 5-azaCR诱导后再植入心肌疤痕,可改善心功能,但肌浆球蛋白重链却显示阴性,并且对心肌连接蛋白 Connexin43 的表达也有不同报
11、道.由于已有研究结果存在的争议对 MSCs 移植修复治疗病损心肌的应用前景带来一定影响,故本课题将经 5-azaCR 体内活性代谢产物 2 脱氧 5 一氮杂胞苷(5-aza-2-deoxycytidine,5-azaCdR)诱导后的 MSCs 植入 MI10d 大鼠心肌疤痕中,用双重免疫组化方法和电镜观察,对MSCs 体内分化进行分析,并用心脏超声评价心功能的改善情况.1 材料和方法1.1 实验动物 2003 年 5 月一 2004 年 9 月,同基因背景近交系 Wistar 大鼠,雄性,51 只(中科院上海实验动物中心提供).其中 200250g2 只提供MSCs,250300g49 只建立
12、动物模型作为移植对象.1.2 细胞分离与培养按 CaplanS 方法,将大鼠麻醉致死,获取股骨,胫骨,去除长骨两端,用完全培养液(DMEM,购于 Gibco,150ml/L 胎牛血清) 冲洗骨髓腔获取骨髓细胞,离心,混悬 2 次后以 510/ml 接种培养.每 3d 换液 1 次,弃去非贴壁细胞,80% 90%融合时用 2.5g/L 胰酶+0.2g/LEDTA消化,1:3 传代.传代 2 次后的细胞用于进一步诱导,标记,鉴定及移植.1.3 细胞诱导与标记第 2 代 MSCs 传代后第 3天予 5-azaCdR(0.3mol/L)干预,24h 后换液.移植前再予 5-azaCdR 处理 24h.
13、移植前 2d 予溴氮胞苷(bromodeoxyuridine,BrdU,0.01mg/m1)标记示踪.便于在受体心肌中辨别.24h 后换液,继续培养 24h(此时予第 2 次 5-azaCdR 诱导),之后进行细胞鉴定,移植.1.4 细胞免疫组化分析诱导,标记后的 MSCs40异/L 中性甲醛溶液固定 10min,PBS 震洗 3 次,分别与一抗 Vimentin(DAKO,1:100 稀释),CD34(DA KO,即用型),抗 BrdU 单抗(Sigma,1:800 稀释)4孵化过夜.加抗 BrdU 单抗前需 2mol/L 盐酸 3730min 进行 DNA 变性.PBS 代替一抗作阴性对照
14、.其他步骤按即用型第 2 代免疫组化 EliVision.Mplus广谱试剂盒(福州迈新) 操作程序进行,经 DAB 显色,苏木素复染.每张切片在放大 400 倍下随机取5 个视野,计算每个视野阳性与阴性细胞数,取得均值后计算阳性细胞所占比例.本研究用 Vimentin这一间充质来源阳性指标进行 MSCs 阳性鉴定,CD34 造血谱系阳性指标排除造血干细胞进行 MSCs阴性鉴定,了解通过 CaplanS 方法培养的第 2 代MSCs 纯化情况 .1.5MI 后 HF 模型建立及 MSCs 移植 49 只大鼠分成假手术组(8 只) 和 MI 组(41 只), 在呼吸机支持下经左外侧开胸切口暴露心
15、脏.假手术组撕开心包后即关胸.MI 组于左前降支下置缝合线结扎,成功者可见左室前壁心肌变紫黑并活动障碍.术后10d 心超检测心功能后,MI 组分成 MSCs 组和DMEM 组,第 2 次开胸于心外膜注射移植.MSCs 组予 210/l 诱导,标记后的 MSCs150Ixl,分 3 点注入梗死区心室疤痕.DMEM 组予等体积无血清DMEM.1.6 超声心功能检测 MI 后 lOd(移植前)和移植后 1 月用超声(HP5500)检测心功能.以 HP 小动物超声探头(15MHz)在大鼠胸骨旁以二维超声和M 型超声进行心脏形态和功能检测,舒张末期和收缩末期左室长轴面包括心尖部,后乳头肌,二尖瓣和主动脉
16、瓣.测量指标有室间隔厚度(IVS),左室舒张末期内径(LVEDD),左室收缩末期内径(LVESD)等.左室射血分数(LVEF), 左室缩短分数(FS)通过 M 型超声按 HP5500 的 Teich 模式获得.FS=(LVEDDLVESD)/LVEDD100%.LVEF=(左心脏杂志(ChinHeartJ)2006,18(2)室舒张末期容积一左室收缩末期容积)/左室舒张末期容积 x100%.1.7 心肌双重免疫组化检查移植后 1 月的大鼠心脏石蜡包埋后,制作 4llm 连续切片,分别进行抗BrdU 和 TroponinT,抗 BU 和 Connexin43 双重免疫组化检查.需经 2moL/L
17、 盐酸 3730minDNA 变性,胰酶 3715min 抗原修复,其余步骤按 DouS-P 免疫组化双染试剂盒 (福州迈新)操作程序进行.第一次第一抗体为抗 BrdU 单抗(Sigma,1:800稀释),4 孵化过夜,采用 BCIP/NBT/碱性磷酸酶系统,阳性显色为紫黑色.第二次第一抗体为 Tr0-poninT(Neomarker,1:100 稀释)或 Connexin43(Neo-marker,1:50 稀释),4孵化过夜,采用 HO/AEC/过氧化酶系统,阳性显色为深红色.PBS 代替一抗作阴性对照.TroponinT 为心肌特异性的结构蛋白 ,阳性说明其向心肌细胞分化.Connexi
18、n43 为心肌连接蛋白,阳性说明有细胞间缝隙连接生成,形成闰盘.1.8 透射电镜观察随机取 MSCs 组 2 只大鼠左心室心肌(包括疤痕及周围心肌),迅速浸入 20ml/L戊二醛固定.组织块修成约 1mm,先切厚片定位,再切薄片透射电镜观察.1.9 统计学分析数据以s 表示,统计分析均在 SPSS11.5 软件系统完成.假手术组与 MI 组,MSCs 组与 DMEM 组之间比较采用团体 t 检验.每组内不同时期的比较:如移植前后采用配对 t 检验.2 结果2.1 细胞 MSCs 培养细胞接种 24h 后可见部分大圆形单核细胞贴壁,3648h 后贴壁细胞增多,经 24d 休眠后,细胞成对数快速增
19、殖,长出突起呈梭形或扁平形,绝大部分成纤维细胞样,56d形成分散的集落,l214d 后即达到 80%一 90%融合,予 1:3 传代.传代后 MSCs 迅速贴壁,伸展,重新呈梭形或扁平型,以后一般 7d 达 80%一 90%融合而传代 1 次.造血干细胞非贴壁生长,随每次换液逐步减少,传代 2 次可获较纯的 MSCs.第 2 代MSCs 经 5-aza-CdR 两次诱导后 ,没有明显形态学改变,经 BrdU 标记,达 80%一 90%融合后用于移植.移植前 MSCs 免疫组化检测:Vimentin 阳性率接近100%(图 1A),CD34 染色阴性,说明已获较纯的MSCs.抗 BrdU 单抗阳
20、性率达 (77.51.3)%(图 1B).2.2 大鼠心功能测定及存活率情况假手术组大鼠术后 10d 全部存活(8/8),心功能LVEF:(92 4)%,FS=(596)%,n=8与术前LVEF:(942)%,FS=(624)%,n=8相比均无显着性差异.MI 组大鼠术后 10d 存活率 78%(32/41),有 29 只LVEF80% LVEF=(61 12)%,FS:(308)%,n=29,较假手术组心功能显着下降(P0.O1).将这 29 只大鼠随机分为 MSCs 组和 DMEM组,移植前两组心功能无显着性差异,移植后 1 月存活率分别为 87%(13/15)和 86%(12/14).移
21、植后 1 月 MSCs 组大鼠心功能较移植前有显着改善(P0.O1),而 DMEM 组大鼠较移植前心功能有进一步恶化(P0.01);并且移植后 1 月,MSCs 组与DMEM 组相比,LVEF,FS 改善有显着性差异(P0.01),详见表 1.表 1 移植前后大鼠心功能比较(s,%)与本组术前比较,P0.01;与 DMEM(对照)组同期比较 dP0.01.2.3MSCs 在 MI 区分化情况移植后 1 月,在 MI疤痕中有肌岛形成,以靠近 MI 边缘居多.肌岛中有抗 BrdU 阳性细胞,双重免疫组化提示:其中部分细胞 TroponinT 阳性(图 2).这些细胞中,有的细胞呈长梭形,核浆比例小
22、,细胞核椭圆形,位于细胞中央,与心肌细胞十分相似(图 2 中红箭头所示);有的细胞胞核较大,呈长梭形,核浆比例大,这点与原始的心室肌细胞类似(图 2 中绿箭头所示).另外,也发现抗 BrdU 阳性细胞参与 MI 区域的血管生成.抗 BrdU 与 Connexin43 双重免疫组化染色发现:在心肌疤痕中,抗 BrdU 阳性移植细胞之间未发现形成紧密的细胞缝隙连接,Connexin43 染色阴性;但在疤痕周围心肌组织处,有抗 BrdU 阳性细胞与周围心肌 Connexin43 染色阳性,形成类闰盘结构的紧密细胞连接(图 3 箭头所示).2.4 电镜检查结果在 MI 疤痕中,有外来移植细胞存在:有的
23、细胞较长,胞核大,两边钝圆,类似心肌细胞的椭圆形核(不像成纤维细胞,其核两边呈梭形),内常染色质与异染色质共存,并且常染色质比例较高,细胞浆不丰富,内有线粒体与较多刚发育的肌丝,排列不规则(图 4 箭头所示);有的外来细胞形态介于成纤维细胞与心肌细胞,内也有肌丝样结构存在.在电镜观察中还发现有外来细胞与心肌细胞形成紧密的缝隙连接,类似闰盘结构(图 5).而在心肌中,一般只有心肌细胞之间能够形成紧密的缝隙连接.?142?心脏杂志 (ChinHeartJ)2006,l8(2)的基质构成.本研究在大鼠 MI10d 后即予 MSCs移植,此时 MI 后 HF 模型已形成,但在 MI 疤痕内仍有少量心肌
24、及微血管残存,可能利于移植的 MSCs存活及向心肌细胞分化.电镜观察中发现疤痕中有移植的 MSCs 形成肌丝,但未发现形成 z 带及肌小节.是由于电镜中外来植入细胞的示踪困难性而遗漏了观察,还是在 1 月的观察期内 MSCs 的确未形成 Z 带与肌小节,今后需进一步探讨.国外有文献报道,BrdU 标记的移植细胞在 MI 疤痕中 4 周后能分化为 cTnI 阳性的细胞 ,并形成 z 带及肌小节.但该结论是通过连续切片分别作 BrdU 染色与cTnI 染色,然后对比得出的 ,可能不很确切.双重免疫组化染色是在同一张切片上进行同一细胞两种蛋白表型的分析,两种蛋白表型在细胞中需定位不同才能分辨.抗 B
25、rdU(阳性染色部位在胞核)与TroponinT(阳性染色部位在胞浆)的双重免疫组化染色对研究移植细胞的分化情况具有较准确的价值.本研究发现在 MI 疤痕中有移植的 MSCs(抗BrdU 阳性)其 TroponinT 阳性 ,具有心肌特异性的结构蛋白,但未发现形成 z 带与肌小节 .同时电镜检查结构也支持该结果.故本研究得出的 MSCs 在心肌疤痕中移植 1 月后,能向心肌细胞分化,形成肌丝,但未形成 z 带与肌小节的结论可能比较准确 .MSCs 除向心肌细胞分化,还分化为血管内皮细胞.其改善微循环,使大量冬眠心肌复苏而恢复舒缩活力,避免了冬眠心肌缺血,缺氧而凋亡,结果被纤维组织取代.可能正是
26、由于 MSCs 在 MI 疤痕中向心肌细胞分化进行肌细胞补充;在缺血区再生侧支血管改善局部血液灌注使冬眠心肌恢复舒缩这两大机制,改变了 MI 后左室重构过程,使 MI 后心衰大鼠心功能有明显改善.移植后 1 月,MSCs 组大鼠的LVEF:(83 8)%,n=13较 DMEM 组(47 士12)%,n:12有显着提高(P0.01); 并且较移植前(6410)%,n:13 也有显着改善(P0.01).MSCs 在心肌疤痕中是否随时间凋亡及其改善心功能的长期作用,有待进一步研究探讨.参考文献:1MakinoS,FukudaK,MiyoshiS,eta1CardiomyocytescaubegencratedfrommarrowstromalcellsinvitroJ.JClinInvest,1999,103(5):697705.2WangJS,ShumTimD,ChedrawyE,eta1.Thecoronarydeliveryofmarrowstromalcellsformyocardialregeneration:pathophysiologicandtherapeuticimplications【J.JThoracCardiovascSurg,2001,122(4):699705.
