1、骨髓多能干细胞移植治疗股骨头缺血性坏死的实验研究.122-介入放射学杂志 2007 年 2 月筮鱼鲞篁塑堡!垦!:!:鱼!:?实验研究 Exr“,ntresearchxperlmentresearc13?骨髓多能干细胞移植治疗股骨头缺血性坏死的实验研究白彬,曹海利,王凯冰,王宏辉,徐伟,张守信【摘要】目的探讨骨髓多能干细胞移植治疗股骨头坏死的疗效和机制.方法选用日本大耳白兔60 只,随机分为 A,B,C3 组 ,制成激素性股骨头坏死模型.A 组兔抽取骨髓体外分离后,将骨髓干细胞注入钻孔减压的左侧股骨头内,右侧仅钻孔减压;B 组模型未治疗组;C 组为正常组.各组动物于治疗后 8 周处死,处死前后
2、分别进行各种指标检测,包括钼靶 X 线摄影,CT 扫描,MR 扫描,常规 HE 染色切片,电镜扫描超微结构观察.结果股骨头穿刺骨髓干细胞移植后 8 周,骨质密度 X 线,CT和 MR 明显好转 .病理组织学表现空骨陷窝减少,成骨细胞增多,新骨形成.电镜下可见成骨细胞内细胞器丰富,空骨陷窝减少.经骨髓多能干细胞移植治疗后显示股骨头修复效果更佳.结论骨髓多能干细胞移植治疗股骨头坏死能加速兔股骨头的修复进程,对股骨头坏死具有较高的治疗价值.【关键词】股骨头坏死;骨髓多能干细胞;钻孔减压;移植中图分类号:R681.8 文献标识码:A 文章编号:1008794X(2007)一 02012205Anexp
3、erimentalstudyonthetreatmentoffemoralheadnecrosiswithtransplantationofmarrowstemcellsBAIBin,CA0Hai-li,WANGKai-bing,WANGHong-hui,XUWei,ZHANGShou-xin.DepartmentofRadiology,theSecondHospitalAffiliatedtOHarbinMedicalUniversityHarbin150086,China【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectandmechanismoftrans
4、plantationofmarrowmultifunctionstemcellsintreatingfemoralheadnecrosis.MethodsSixtyjapaneserabbitsweredividedintoA,BandCgroupsrandomly.Aftercreationofthemodelsofhormoneinducednecrosisoffemoralhead;Agroupwasdesignatedasthetreatment,BasthecontrolandCasthenormalgroups.ThebonemarrowofAgroupWasextractedan
5、disolatedandtheninjectedintotheleftfemoralheadandtherightfemoralheadWasdecompressedbydrillingonly.Therabbitswerekilledat8weeksafterthetreatmentandchangesinVaYiOUSparameterswereobserved,includingimagingdataofmolybdenumtargetfilms,CTandMRI;routinepathologywithHEstaininganduhrastructuralalterationbyele
6、ctionmicroscopy.ResultsEightweeksafterthetreatmentoftransplantationofInalTowmuhifunctionstemcells,theX-rayshowedonlyalittlechangebutthetypicalappearanceswererevealedbyCTandMRI.Pathohistologicmanifestationdemonstrateddecreaseofemptybonelacuna,increaseofosteoblastandnewboneformation.Electionmicroscopy
7、displayedabundantorganellesinosteoblaststl1fewemptybonelacuna.inadditionthetansplantationofmarrowmuhifunctionstemcellscouldobtainbetterreconstractionfortheinvolvedfemoralhead.ConclusionsThetreatmentoftransplantationofmaITowmuhifunctionstemcellsinfemoralheadnecrosiscouldacceleratetheprocessofrepairin
8、g,worthytobeacknowledgedasagoodandvaluablemanagementinrabbits.(JInterventRadiol,2007,16:122126)【Keywords】 Femoralheadnecrosis;Marrowstemcells;Drillingdecompression;Transplantation股骨头缺血性坏死是临床常见难治性疾病,近年来该病的发生率不断增高,发病年龄趋于年轻基金资助项目:黑龙江省科学自然基金【D200560)作者单位:l5o086 哈尔滨医科大学附属二院放射介入科(白彬,曹海利,王凯冰,王宏辉,徐伟);哈尔滨医科大
9、学基础医学院解剖学教研室(张守信)通讯作者:白彬化.因其临床症状较重,致残率高而越来越引起医学同道的重视.尽管目前治疗方法很多,且不断有新的方法问世,但治疗效果都不十分理想.随着干细胞工程与组织学工程的进展,骨髓多能干细胞移植已成为研究和治疗缺血性疾病的重要方法.本实验对家兔股骨头坏死模型进行自体骨髓多能干细胞移植,观察其疗效,初步探讨骨髓多能干细胞治介入放射学杂志 2007 年 2 笫鱼鲞箜塑!旦!: 垒:疗股骨头坏死的机制.1 材料与方法1.1 动物及模型的制备健康成年(20 26 周龄) 雄性日本大白兔 60只,平均体重(2.50.25)kg,由我院动物实验中心提供.模型制作:取 40
10、只兔臀肌注射氢化可的松,剂量每次 8mg/kg,每周 2 次,连续注射 8 周.每周肌注青霉素 2 次,每次 10 万 u/只,预防感染.8 周后所有动物行影像学检查,证明已发生股骨头坏死后分为 A,B 两组;剩余 20 只正常兔为 C 组,注射同等量的生理盐水.1.2 骨髓干细胞分离从 A 组各兔分别经髂前上棘穿刺抽取 23rrIl骨髓缓缓沿壁加入到盛有 l0rnl 淋巴细胞分离液(Ficol1)的离心管中,2000g 离心 20min,在上,中层液体界面处可见乳白色混浊单个核细胞层.将吸管轻轻插到白膜层,沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞,移入另一试管中,用 PBS 液反复洗涤以去除脂肪及组
11、织液,加入 PBS 溶液,以 1500g 离心 5min,弃上清液,留底部沉淀部分,再加入 PBS,如上述离心数次,以 EDTA46ml 强化数分钟,弃去消化液,加入 PBS,吹打成单细胞悬液 ,分别标号备用.1.3 实验方法1.3.1 干细胞移植将 A 组动物置于 DSA 手术床上,经耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉后,在兔髂前上棘和双侧股骨头区域备皮,局部消毒铺无菌单,切开皮肤,分离皮下组织暴露股骨干,于大粗隆后用微型电钻钻入 5mm,改用 20rrIl 注射器针头在DSA 透视下穿刺至股骨头下 1mm 处,左侧注入已分离,标号备用的自体骨髓多能干细胞原液 1rrI1,并用明胶海绵封闭穿刺口,右
12、侧为对照钻孔减压,关闭切口逐层缝合.术后给与青霉素(20 万 u/只)预防感染.1.3.2 模型未治疗组(B 组)和正常组(C 组)未采取任何处理.8 周后处死动物,进行各种指标观察与检测.1.4 观察指标与检测方法1.4.1 影像学观察制作模型前后及处死前,分别行钼靶 X 线摄影,CT 和 MR 扫描,采集影像学资料.1.4.2 组织病理学检测实验结束后处死动物,取双侧股骨头,沿中心冠状面剖开,甲醛固定,脱钙后进行常规 HE 染色,石蜡包埋.在 400 倍高倍镜下,任选 5 个高倍视野计数 50 个骨细胞空骨陷窝阳性数;在软骨下区依次任选 5 个高倍视野,计数血管数目,求出平均值;任选 5
13、个视野测量 10 个骨髓腔内脂肪细胞直径,求出平均值.1.4.3 电镜观察 4%戊二醛固定,脱钙 3 个月,环氧树酯包埋,透射电镜观察骨细胞改变,包括骨细胞形态,胞质,胞核和细胞器等.1.4.4 统计学方法实验数据均用s 表示,统计学分析采用多样本的方差分析和 Dunnett 检验.2 结果2.1 大体改变A 组左侧移植组股骨头表面为亮白色,沿冠剖破开阻力大,骨质较硬,股骨头表面软骨较厚;右侧钻孔减压组股骨头表面为粉白色,沿冠剖破开阻力较左侧小,骨质略硬,股骨头表面软骨较左侧薄.B 组股骨头表面为暗红色,关节软骨下骨质暴露,部分可见裂隙,变形,沿冠剖破开阻力小,骨质松脆,股骨头表面软骨较薄.C
14、 组股骨头表面为亮白色,沿冠剖破开阻力大,骨质硬,股骨头表面软骨厚.2.2 影像表现治疗前及治疗后 8 周处死前每组动物分别进行钼靶 X 线摄影,CT 和 MR 扫描,前后对比观察.2.2.1 钼靶 X 线摄影实验前所有模型兔与正常兔股骨头相比较,结果骨密度略低,其他改变不明显,实验后 A 组两侧骨密度略低于正常,未见明显改变;B 组骨密度明显降低,骨小梁稀疏.2.2.2CT 扫描 A,B 模型兔实验前双侧股骨头骨皮质较薄,内部骨密度较低,骨小梁变细或中断,可见小囊状透光区及小片状死骨;治疗后 A 组左侧股骨头骨密度明显增高,接近正常骨密度,CT 值 720Hu 左右,关节面光整,内部放射状骨
15、小梁清晰可见;右侧骨皮质较左侧薄,内部骨密度较左侧略低,CT 值 530Hu 左右,可见骨小梁略细,部分中断,偶见囊状透光区(图 1),左右 CT 值对比差异显着.B组较实验前 CT 改变加重,股骨头骨皮质较实验前更薄,股骨头表面骨皮质断裂,塌陷(图 2),内部骨密度很低,CT 值 390Hu 左右,大部分骨小梁中断伴大小不等囊状透光区,边缘硬化,可见斑片状死骨;C 组双侧股骨头骨皮质厚,内部骨密度高,CT 值830Hu 左右,骨小梁呈放射状分布.2.2.3MRI 成像 A 组左侧股骨头 MRI 表现为TWI 呈线样低信号,E 呈高信号,右侧 MRI 表现为 TWI 呈不均匀低信号 ,T 呈中
16、等稍高信号嘲:均匀硝低信绕,坚型帕瑕线;h州 MRT 矗理 T.wl 呈带状 1 氐信号 w】中等或r 岛估2.3 组织 I理寮13IlJE 染包 A 组车恻 r 细胞移植纲清 j 后 8嗣,日小桨尘细埘!毛绑 m 管增多,细数接近 lll 船“J 少卒骨躺寓咆 R 成侣田胞投节 W显增多功能活跃,新目增多删钻孔诫组表现色圳符略有增 I.骨胞略少,-T 定监怕士日陷寓细忸【罔 36),筋侈植 TL 腻厩垃钻 L脯与模未淆竹.鲲(B 绀)二较有瞢一蚪(尸(005):B 绀木晤 8,牺坦政加重辆埋 j 呈的骨坏,J 死域 f 于股,带近脞目颓松质目处.竞界址盲大 nJ 充质细胞增乍.髓脏 i 充满
17、坏柏碎片日小坏北日隋寓审缺或泞细胞鹾端.同 u 寸伴有-陛牲钏胞聚非.1 止重占出观片小罂断裂(7):C 组胜软骨 J,屯细 l【管数目多片小耀排列觇 0l0 齐,骨细胞清晰.H 黼内脂脐咆大小仆均句各组化指杯 n_L 袁 I2.32 电镜观察纽左侧 f 圳胞纠目细胞状态完好恒艇完清晰.纯粒悼粗 I 面内皿 l 州等耋 If1 胞器丰富,基晴清晰可见目小染边缘以前脏骨胞为主(8)右侧透射电镜下修复医的甘胞u禽 IntI7Jl*3Z呈多 J 核樘完坚 u 跤粘柑内脏_圳等细胞器 H 绀【雠下骨匝止形襄孔业 I 面崭懂碱骶.可见 J=砭 H 细恤.细胞帜川缔胞幔线柑 f 水空泡业残余制细峋恋不觇刚
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20、1 胞近 q 三束随着对骨随成骨潜j;i 研究,已宴一日髓辐质细胞能住休卜培捧转化为成 H 细胞-,n 条什培养渡?可成甘奉寓骑巾髓蚍骨黜移植后缺骨旧寓救较其他组叫减少.局有绑胞增I;影像资料示骨小增多,增籼.说埘骨髓移植后腔骨头H 饨已发十l成骨作 JH.所 门为移悄斤日黼干细【胞存 J 一部缺区瞬导分化为十细胞参l_r 坏医的修垣骨髓多能 l 细胞内舍自 m_符皮1俚(El1I:PC 丰世俘 l 十人和动物骨韶巾 E 足再赶稚新生管的丰霹 lI 魁“,通过 jn 奇或打惜.:JI 外束骨髓多能 1 二胞性逊新 Ifll 管牛成和毖生赛验巾骨髓 l 细胞移精增股骨央 H 死 fill 管蝴轾
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