1、文库下载 免费文档下载http:/ 年第 35 卷第 1期大孔吸附树脂法分离石榴籽中总多酚及其抗氧化活性研究侯晓丹，袁其朋*，田海源(北京化工大学生命科学与技术学院，北京市生物加工重点实验室，北京 100029)摘要：以安徽怀远石榴加工废弃物石榴籽为研究对象，建立了大孔吸附树脂纯化石榴籽中总多酚的方法：选择 AB-8 大孔吸附树脂为实验树脂，吸附过程为单分子层吸附，吸附等温线符合 Langmiur 方程，拟合方程为 y=0.01211 0.02086x，R2=0.9977，理论最大吸附量为82.56mg/g 湿树脂。石榴籽乙酸乙酯提取物水溶液以 0.75mL/min 流速上柱，以 0.5mL/
2、min流速洗脱，所收集产品总多酚含量由 53.13%提高到 78.80%；在 Schaal 烘箱实验中，12d 后添加树脂富集的总多酚的猪油过氧化值为添加石榴籽乙酸乙酯粗提物猪油的 1/3，为空白对照猪油的近 1/9。关键词：石榴籽；总多酚；大孔吸附树脂 AB-8；抗氧化中图分类号：TQ463.2文库下载 免费文档下载http:/ 0.02086x,R2=0.9977;thetheoreticalmaximumadsorptioncapacityofadsorbedtotalpolyphenolcontentwas82.56mg/g.Keywords:pomegranateseeds;poly
3、phenol;macroporousresinAB-8;antioxidantion石榴(Pomegranate)原名安石榴，石榴科，为落叶灌木或小乔木，原产地为亚洲中部伊朗及其周边地区。随着市场经济的发展，石榴的种植面积不断扩大，逐年增加 5 万多 t/(年*区)；但是人们对于占石榴总质量约 12.54%的石榴籽1的价值缺乏认识，导致大量的种子作为废料丢弃。如果对石文库下载 免费文档下载http:/ 年第 35 卷第 1http:/ 期FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY提取物与应用明，石榴多酚因分子结构中的众多酚羟基具有多膏状物。方面的生物活性，包括抗氧化作用、抗癌作用、取浸膏
4、溶于 300mL 去离子水中，分别按15 抗动脉粥样硬化作用、降血压和预防心脑血管疾加入氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取液病、抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌、淋球菌作及最终的萃余液减压蒸干，称质量。用、抑制细胞内病毒增殖等功效2-4。文库下载 免费文档下载http:/ AB-8，HP20，D141，D3520，孔结构，具有比表面积大、吸附容量大、选择性 H103，无水乙醇浸泡树脂 24h 后用去离子水冲好、吸附速度快、解吸条件温和、容易再生等诸洗，直至流出液与去离子水混合无混浊现象，再多优点，近年来在天然产物分离纯化中的应用越用蒸馏水冲洗至流出液无乙醇味。来越多。取不同型号已处理好的抽干树脂
5、各 1g，分别本文以安徽怀远石榴加工废弃物石榴籽为研装入加有 50mL0.5mg/mL 乙酸乙酯相粗提物中，究对象，通过选择大孔吸附树脂及考察纯化石榴水浴振荡(25、115r/min)24h，测上清液的平衡籽中总多酚的方法并对这部分总多酚的抗氧化能多酚质量浓度 e(mg/mL)；滤去提取液后树脂经蒸力进行讨论。馏水洗两次，再放入 50mL 无水乙醇中，于相同 1 实验部分条件下解吸，测定解吸液的多酚质量浓度 d(mg/mL)。分别按下式计算吸附量、吸附率、解吸 1.1实验材料及试剂率和解吸物的多酚质量分数，从中筛选出性能最石榴籽：安徽怀远；石油醚(沸程 3060)、好的树脂进行后续实验。乙酸乙
6、酯、无水乙醇、碳酸钠、冰醋酸、氯仿：吸附量(mg/g 湿树脂)=(0-e)V0/m文库下载 免费文档下载http:/ 公司；Folin-Ciocaheu 吸附率(%)=(0-e)100/0 试剂：合肥博美生物科 http:/ 技有限责任公司；AB-8、解吸率(%)=d100/(0-e)H103、D3520：南开大学化工厂；HP20：三菱化解吸物的多酚质量分数(%)=dVd100/md学；D141：成都晨光实业有限责任公司。式中：0 为提取物溶液中多酚质量浓度，1.2 总多酚的测定mg/mL；1.2.1 总多酚标准曲线的绘制及样品的测定步骤 V0 为提取物溶液体积，mL；精密吸取没食子酸标准溶液
7、 0、0.20、0.40、Vd 为解吸液体积，mL；0.60、0.80、1.00mL 及样品溶液 0.20mL，置于 10m 为树脂质量，g；mL 的容量瓶中，分别加入水溶液 6mL 和福林-md 为解吸液中固形物的质量，mg。酚溶液 0.5mL，混匀，放置 1min，加入 10%碳酸 1.4吸附等温线钠溶液 3mL，加水稀释至刻度，25下反应 2h，分别将 1g 抽干树脂置于 50mL 不同 0 的提在波长为 760nm 处测定吸光度(实验步骤见表 1)，取物溶液中，25、115r/min 振荡吸附24h 后测绘制标准曲线及测定样品总多酚含量。其上清液的 e(mg/mL)，绘制吸附等温线。表
8、 1 多酚标准曲线绘制及样品总多酚含量测定的实验步骤文库下载 免费文档下载http:/ 吸附动力学实验编号 123456 样品取 1g 抽干树脂于 50mL 一定 0 的提取物溶没食子酸/mL00.200.400.600.801.000.20液中，25、115r/min 振荡吸附，于 1、2、3、水溶液/mL66666664、6、8、10、24h 取上清液，测其多酚质量浓 F-C 溶液/mL0.50.50.50.50.50.50.5度，绘制吸附动力学曲线。混匀，放置 1min1.6解吸剂的筛选10%碳 http:/ 酸钠溶液/mL3文库下载 免费文档下载http:/ 50mL 甲醇、无水乙醇及
9、体积分数为加水稀释至刻度，25下反应 2h，760nm 下测吸光度值70%的甲醇、乙醇水溶液加入到含 1g 饱和吸附树 1.2.2 石榴籽成分溶剂分级萃取称取经石油醚脱脂的磨口三角瓶中，25、115r/min 振荡解吸，过脂的石榴籽粉 1735.3g，按 15 的比例加入 65%于 1、2、4、6、8、12、24h 取解吸液，测其 d，的乙醇，先浸泡 4h，然后置于超声波提取器中超绘制静态解吸曲线。声提取 1h，取出，抽滤，50减压蒸干，得褐色1.7 树脂吸附穿透曲线的测定195提取物与应用文库下载 免费文档下载http:/ 0.0124R2=0.9997食品科技2010 年第 35 卷第 1
10、期取 10mL 大孔树脂湿法装柱，1mg/mL 的石榴籽乙酸乙酯提取物水溶液分别以0.5、0.75、1.5mL/min 流速上样，每 10mL 为 1 份收集过柱液，测定过柱液多酚含量，绘制穿透曲线。1.8树脂洗脱曲线的测定先用蒸馏水将饱和吸附的树脂洗至流出液无色，再用已选出的洗脱剂以 0.5、1.0、1.5mL/min 的流速洗脱，每 2.5mL 为 1 份收集洗脱液，检测洗脱液多酚含量，绘制洗脱曲线。同时合并洗脱产品，测定总多酚含量。1.9 产品总多酚抗氧化能力测定将洗脱得到的总多酚以及未经树脂富集过的乙酸乙酯粗提物分别溶解在 0.5mL 蒸馏水中，与20g 猪油混合，加入 0.6%吐温-
11、80 在干燥的 100mL 烧瓶中，于 80下用恒温振荡器振荡至油http:/ 免费文档下载http:/ Schaal 烘箱法6测定抗氧化能力。将所有油样同时放入(601)电热恒温培养箱中，于第 0 天、第 2 天、第 4 天、第 6 天、第 9 天、第 10 天、第 12 天测定过氧化值。氧化值测定方法：称取 2.00g 混匀的样品，置于 250mL 锥形瓶中，加 30mL 三氯甲烷-冰乙酸(21)混合液，使样品完全溶解。加 1.00mL 饱和碘化钾溶液，塞紧瓶盖，并轻轻摇0.5min，然后在暗处放置 3min，取出加水 100mL，摇匀，立即用 Na2S2O3 标准滴定液(0.002mol
12、/L)滴定，至淡黄色时，加入 1mL 淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为终点；取相同量三氯甲烷-冰乙酸(21)混合液，碘化钾溶液，蒸馏水，按上述方法作空白对照。POV(MEQ/kg)=C(V1-VO)/M100式中：V1 为消耗 Na2S2O3 标准滴定液体积，mL；V0 为空白实验消耗 Na2S2O3 标准滴定液体积，mL；C 为 Na2S2O3 标准滴定液浓度，mol/L；M 为油样质量，g。22.1实验结果及讨论%0.20.3 浓度/(mg/mL)0.40.5文库下载 免费文档下载http:/ 1 总多酚标准曲线用氯仿、乙酸乙酯及正丁醇对提取液进行萃取后，从各相总多酚含量测定结果来看，总多
13、酚大多集中在乙酸乙酯相中，此相总多酚含量已从 65%乙醇提取物的 34.99%提高到 53.13%，溶剂分级萃取一方面可以根据物质的“相似相溶”原理，可以分别得到相应极性的物质及萃取物，将提取液中的物质进行初步的分离；另一方面可以除去提取液中的大分子物质，如蛋白质及盐分，得到较为纯净的产品，避免造成对大孔吸附树脂柱的堵塞及污染。因此，在后续实验中，将利用大孔吸附树脂对于乙酸乙酯相萃取物中总多酚进行进一步富集。表 2 溶剂分级萃取各相产品质量和总多酚含量测定结果成分总浸膏氯仿萃取物乙酸乙酯萃取物正丁醇萃取物:/ 质量/g59.88.54091.83557.1470总多酚含量/%34.995.91
14、53.138.512.3 树脂的筛选本文选择了 5 种文献中报道过的对于植物多酚，特别是石榴多酚有较好选择性的非极性和弱极性的树脂以及实验室现有的树脂 AB-8、HP20、D141、D3520、H103 进行静态吸附和解吸实验7-8，1009080706050403020100文库下载 免费文档下载http:/ 73.8359.9289.0096.00总多酚标准曲线的绘制根据标准曲线的制作方法，以浓度(C，mg/mL)为横坐标，吸光值(A760nm)为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程：y=10.301x 0.0124(x为浓度，单位 mg/mL，y 为吸光度)，R2=0.9997。2.2 石
15、榴籽成分溶剂分级萃取文库下载 免费文档下载http:/ 25 种大孔吸附树脂吸附率和解吸率食品科技2010 年第 35 卷第 1期 FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY提取物与应用以选择得到对石榴籽多酚有着高吸附率和解吸率对石榴籽多酚的吸附属快速吸附平衡型。的树脂。由图 2 可以看出，AB-8 在对于石榴籽乙酸乙 20 酯提取物中总多酚的吸附率和解吸率均较其他 4)g15 种大孔吸附树脂高，分别为 77.05%和 96.40%。大/gm(孔吸附树脂对于目标物质的吸附和解吸特性是综/量 10 合极性、骨架结构和孔径等多方面的影响；AB-8 附吸为一种弱极性树脂 http:/ 目)，平
16、均孔径为 30140，比表面积为 0480520m2/g。这些特性的组合对于同时存在多个 02468101214161820222426时间/h亲水的酚羟基，和疏水的桔酰基和鞣花酰基的石图 425AB-8 对石榴籽总多酚吸附动力学曲文库下载 免费文档下载http:/ AB-8 对于石榴籽中总多酚进行富集分离。2.6解吸剂的筛选2.4吸附等温线对所选洗脱剂的要求有两方面：一是要求洗吸附等温曲线是指在一定温度下溶质分子在脱剂能使大孔吸附树脂溶胀，这样可减弱被吸附两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两物质和吸附树脂之间的吸附力；再则要求所选洗相中浓度之间的关系曲线。吸附量与被吸附物浓脱剂易溶解被
17、吸附物质，因为解吸时不仅要克服度的关系符合 Frendich 或Langmiur 经典吸附式，吸附力，而且当洗脱剂分子扩散到树脂吸附中心即被吸附物浓度增加，吸附量也随之增加；但被后，应能使被吸附物质很快溶解。对非极性大孔吸附物浓度增加有一定的限度，不能超过大孔吸吸附树脂洗脱剂极性越小，洗脱能力越强；对于附树脂的吸附容量。在大孔吸附树脂的吸附容量中性大孔吸附树脂或极性较大的被吸附物质来说，不是很大的情况下一般低浓度下进行吸附比较有则用极性较大的洗脱剂洗脱较为适宜。为达到满利。图 3 为 25时，AB-8 的吸附等温线，按照意的洗脱效果有时需进行梯度洗脱；对于弱酸性 Langmiur 方法进行拟和
18、，得方程 y=0.01211 0.物质可用碱性洗脱剂洗脱，对于弱碱性物质则需 02086x，R2=0.9977。树脂对石榴籽多酚的吸附为要在酸性洗脱剂中进行洗脱。0.18 单分子层吸附，理论最大吸附量为 82.56mg/g。0.16180.1416)文库下载 免费文档下载http:/ 甲醇 g/m 乙醇 g(/70%m12p0.08(70%甲醇乙醇http:/ 100.06 附吸80.0460.0240.005101520252 时间/h0.00.10.20.30.40.50.60.7浓度/(mg/mL)文库下载 免费文档下载http:/ 5254 种洗脱剂对饱和 AB-8 洗脱效果的影响图
19、325AB-8 对石榴籽总多酚吸附等温线评价解吸效果一是要考察洗脱速度，另外还 2.5吸附动力学实验要考察洗脱液中目标产物的浓度。由实验结果可吸附速度是树脂吸附性能的重要参考指标。看出体积分数 70%的乙醇溶液能在最短时间内达 25时 AB-8 树脂对石榴籽多酚的静态吸附动力到解吸平衡，且解吸液的总多酚浓度最高，所以学曲线见图 4。在有充分时间吸附的情况下，有些把洗脱剂选定于 70%乙醇。树脂可能有相近的饱和吸附量。可以看出，06h2.7树脂吸附穿透曲线的测定内 AB-8 树脂对石榴籽多酚的吸附量随时间增加而吸附流速主要是影响被吸附物质向树脂内表增大，之后吸附量较稳定，说明吸附 6h 即可达到
20、面扩散的速度，从而决定了吸附效果。如果流速饱和吸附量 18.06mg/g(湿树脂)，可见 AB-8 树脂太快被吸附物质分子来不及扩散到树脂的内表面197提取物与应用FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY文库下载 免费文档下载http:/ 年第 35 卷第 1期就会发生提早穿透，造成样品流失，对于同一浓度的上样溶液吸附流速增大，树脂的吸附量会随POV/(meq/kg)40之下降。当流出液的多酚质量浓度(mg/mL)达到其上样液的 10%时即认为树脂已穿透。0http:/ 免费文档下载http:/ 时间/d1012图 8 经树脂纯化前后总多酚抗氧化性能能；同时，抗氧化能力与其浓度正相关，
21、即经树脂富集后的总多酚较未经富集的产品有着更强的抗氧化能力。12d 后添加树脂富集的总多酚的猪油过氧化值为添加石榴籽乙酸乙酯粗提物猪油的 1/3，为空白对照猪油的近 1/9，也就是说 78.80%的石榴籽总多酚可以阻止猪油在高温氧化。3 小结图 6 上样流速对 AB-8 的穿透曲线影响由图 6 可以看出，以同样浓度的总多酚提取液上样，随着流速的增大，穿透点提前，并且流出液的总多酚浓度增加，造成了树脂吸附量的降低。所以采用 0.75mL/min 流速上样时，更利于树脂对总多酚的吸附。2.8文库下载 免费文档下载http:/ 70%乙醇做脱附剂，在室温下，分别以石榴多酚因分子结构中的众多酚羟基具有
22、多方面的生物活性；本文通过实验，建立了大孔吸附树脂纯化石榴加工废弃物石榴籽中总多酚的方法：利用 AB-8 大孔吸附树脂富集得到总多酚含量为 78.80%的产品。在 Schaal 烘箱实验中，证实此产品对于底物猪油的氧化有着较理想的抑制作用。通过此部分实验，可以对工业加工的废弃物进行充分利用，即减轻了环境压力，又变废为宝，开发了新资源。参考文献：12刘家富,周家其,李晚谊,等.云南蒙自石榴主要成分分析J.云南农业科技,1995,(6):17-18李志西,王惠.石榴籽油脂肪酸组成分析J.陕西http:/ 林业科技,1992,(4):48-5034李海霞,王钊,刘延泽.石榴科植物化学成分及药理活性研
23、究进展J.中草药,2002,33(8):765-769AbdElWahabSM,FikiNMEI,MostafaSF,etal.CharacterizationofcertainsteroidhormonesinPunicagrarmtumLseedsJ.BullFacPhamaCarioUniv,1998,360.5、0.75mL/min 和 1mL/min 的流速进行洗脱，其洗脱曲线见图 7。各流速的洗脱峰窄均且集中，无拖尾，被解吸的多酚主要集中于 0.53BV 段。提高流速可以使总多酚洗脱速度略有提高，2.5BV 的解吸剂可将吸附的多酚基本完全洗脱，回收率达到 82%。收集的洗脱液经真空
24、浓缩干燥后得纯化样 67.4mg/g(湿树脂)。文库下载 免费文档下载http:/ 免费文档下载http:/ 73 种流速下的洗脱曲线2.9总多酚产品抗氧化能力测定:/ 5BV 洗脱液，按照 2.1 的方法测定总多酚，总多酚含量为 78.8%；将富集后总多酚与未经树脂富集的总多酚抗氧化性进行对比，结果见图 8。由图可以看出石榴籽多酚有着一定的抗氧化功198文库下载网是专业的免费文档搜索与下载网站，提供行业资料，考试资料，教学课件，学术论文，技术资料，研究报告，工作范文，资格考试，word 文档，专业文献，应用文书，行业论文等文档搜索与文档下载，是您文档写作和查找参考资料的必备网站。文库下载 http:/
