1、 上海交通大学博士学位论文人工关节无菌性松动预测与药物治疗研究姓名：张超申请学位级别：博士专业：骨科学指导教师：戴尅戎20070401上海交通大学医学院博士学位论文人工关节无菌性松动预测与药物治疗研究中文摘要目的1.目前关于遗传因素对于人工关节置换术后骨溶解、无菌性松动影响的研究比较少。本研究首次通过小鼠体内试验来研究遗传因素对于磨损颗粒诱发骨溶解的影响。2.目前诊断人工关节术后骨溶解无菌性松动的发生除了结合临床表现进行影像学检查外，尚无有效的方法。本研究通过分析人工关节术后患者的外周血CD14+/CD16+单核细胞比例变化与人工关节关节骨溶解、无菌性松 动发生的相关性，为临床预测、诊断人工关
2、节置换术后假体无菌性松动提供有效手段。3.目前尚无一种能够有效抑制或者治疗人工关节置换术后骨溶解的药物。本研究通过体外及体内实验，（1）探讨强力霉素治疗磨损颗粒诱发骨溶解的作用及相关的治疗机理;（2）定量评价具有抗炎作用的 红霉素对于磨损颗粒诱发骨溶解的保护作用。方法1.取不同遗传背景的 C57BL/J6小鼠，Balb/c小鼠和 Kunming小鼠在颅骨外表面植入 UHMWPE颗粒。1周后取出小鼠颅骨进行体外器官培养及病理处理。通过颅骨的病理学分析，了解不同小鼠遗传背景在磨损颗粒诱发骨溶解破坏程度的差异，并利用 ELISA检测了解器官培养后炎性因子 TNF- 和 IL-1的表达量。2.通过检测
3、分析人工关节置换术后伴有骨溶解的无菌性松动患者、非骨溶解松动患者及骨性关节炎患者外周血中 CD14+/CD16+ 单核细胞比例的变化，以及不同患者关节滑膜的的病理变化,了解 CD14+/CD16+ 单核比例与人工关节假体周围组织病理改变的关系。I上海交通大学医学院博士学位论文3.通过小鼠破骨细胞体外诱导培养，给予强力霉素治疗，了解强力霉素对于破骨细胞生成的影响；通过兔子的成熟破骨细胞体外分离培养，了解强力霉素对于成熟破骨细胞存活及功能的影响。利用 UHMWPE颗粒在诱导小鼠（C57BL/J6） 颅骨溶解模型，然后 给予强力霉素治 疗，通过病理学分析，了解强力霉素对磨损颗粒诱发骨溶解破坏的治疗作
4、用。4.通过体外培养巨噬细胞的培养及在小鼠皮下气囊模型病理学分析气，了解强力霉素对于 PMMA磨损颗粒诱发炎症反应的影响。5.利用 PMMA颗粒诱发在小鼠（C57BL/J6 ）颅骨骨溶解模型，通过对颅骨骨溶解程度和局部破骨细胞数的定量分析。探讨红霉素对于磨损颗粒诱发骨溶解破坏的治疗作用。结果1. UHMWPE颗粒植入 C57BL/J6小鼠、Balb/c小鼠和 Kunming 小鼠的颅骨后，TNF-的表达分泌量没有差别（P0.10 ）。IL-1的表达分泌量不同，颅骨的骨溶解破坏面积不同，骨溶解破坏区域内的破骨细胞生成不同。各参数以C57BL/J6小鼠最 强而 Kunming小鼠最弱（P0.10
5、）。体内磨 损颗粒可以引起明显的小鼠皮下气囊炎症反应，炎性细胞的浸润数量增加和气囊壁增厚，强力霉素全身治疗不能抑制这种炎症变化（P0.10 ）。5.在小鼠颅骨局部植入磨损颗粒可以诱发颅骨局部明显的骨溶解破坏和破II上海交通大学医学院博士学位论文骨细胞生成增加，全身给予红霉素治疗后，局部的骨溶解破坏被抑制和破骨细胞生成减少（P0.10).2. In patients received joint replacement, peripheral blood CD14+/CD16+monocyte percentage increased in those with peri-implant ost
6、eolysis and asepticloosening compared with those without osteolysis and aseptic loosening andosteoarthritis patients(P0.10,P0.10）。1.2.4培养基上清中TNF-表达量C57BL/J6小鼠， Balb/c小鼠Kunming小鼠对照组中颅骨培养上清中的TNF- 含量分16上海交通大学医学院博士学位论文别是11.60.6pg/ml, 11.51.0pg/ml和11.32.0pg/ml 。C57BL/J6 小鼠，Balb/c小鼠Kunming小鼠植入 UHMWPE颗粒组中颅
7、骨培养上清中的 TNF- 含量分别是 11.31.1pg/ml，11.81.1pg/ml和12.03.1pg/ml。各组间无明显差别(P0.10)(图8)。1.2.5培养基上清中IL-1表达量三种小鼠在植入 UHMWPE颗粒到颅骨后 ,器官培养上清中 IL-1的量明显增加(图9)。磨损颗 粒刺激后，IL-1 的量在C57BL/J6小鼠, Balb/c小鼠和Kunming小鼠分别是93.547.1pg/ml, 37.514.7pg/ml和26.513.2pg/ml 。在对照组中C57BL/J6 小鼠 Balb/c小鼠和Kunming小鼠的水平分别是9.71.1pg/ml，9.71.5pg/ml和
8、10.00.7pg/ml 。与对照组相比，UHMWPE颗粒植入后，C57BL/J6小鼠 Balb/c 小鼠和Kunming 小鼠中，IL-1的分泌量增加 (P0.10)。1.2.6颅骨骨溶解和细胞因子分泌的关系颅骨骨溶解面积和IL-1进行双变量Pearson相关分析数据显示，小鼠颅骨在植入UHMWPE颗粒后，骨的破坏和IL-1分泌的量呈正相关(R=0.993,p0.10和P0.10) 。1.3 讨论全关节置换手术对于治疗因为炎性疾病，退行性关节炎和创伤性关节炎引起的关节疾病是一种成功的骨科手术。然而磨损颗粒诱发的假体周围骨溶解和无菌性松动是关节翻修手术的主要原因 9。磨损颗粒在假体周围激活炎性
9、细胞分泌大量炎性因子，诱导破骨细胞分化，诱发侵袭性的细胞反应最终导致假体周围骨溶解破坏和无菌性松动。对于那些因为关节磨损生产假体周围骨溶解和无菌性松动进行关节翻修的患者，人工关节翻修手术具有相当的挑战性，耗时，手术操作复杂，手术创伤大，麻醉时间17上海交通大学医学院博士学位论文长，需要使用昂贵的置入假体和更长的康复时间10,11,12。然而并不是所有存在假体磨损的患者都会产生骨溶解和无菌性松动6,13。有的患者可以在接受关节置换术后超过8年的时间，存在大量磨损颗粒的情况下仅有轻微的假体周围组织反应；而有的患者人工关节置换术后2-7年时间里，在类似的磨损程度下却表现出非常明显的组织反应，最终产生
10、严重的假体周围骨溶解破坏和假体的无菌性松动14。有研究显示，不同健康个体之间的差异可以影响自外周血分离得到的单核细胞对于UHMWPE颗粒的刺激反应，炎性细胞因子表达分泌量的差别可以达到20倍15。后来的研究者也证实了这一发现，分离健康志愿者外周血中的单核/巨噬细胞，给予不同类型和不同直径大小的Ceridust 3615UHMWPE颗粒刺激，然后检测分泌到培养基上清中的IL-1，IL-6和TNF-的表达量，不同个体之间的单核/巨噬细胞对于UHMWEP颗粒的反应差异性比较大，同一种颗粒刺激下，炎性因子的表达分泌量的差别最高可以达到30倍，平均5.8倍 16。这种不同个体的外周血中单核/巨噬细胞对于
11、UHMWPE 颗粒刺激的反应差别可以解释为什么有的患者在关节磨损情况下易于产生骨溶解和无菌性松动而有的比较能够耐受。小鼠动物模型被广泛用于研究磨损颗粒诱发骨溶解的机制及如何用药物来干预磨损颗粒诱发的炎症和骨溶解8,17-21。从小鼠研究中得到的结果增加了对磨损颗粒诱发骨溶解的认识,以及可能用于干预治疗磨损颗粒炎症骨溶解的药物疗效的了解。以前的研究结果显示遗传因素对于小鼠骨的发育、代谢及形态学方面存在明显的影响。C57BL/J6 小鼠和C3H/Hej小鼠之间在骨形态及力学强度有明显的差别 ,皮质骨厚度C3H/Hej小鼠明显高于C57BL/J6小鼠，而在松质骨骨小梁面积及骨小梁数量方面，C3H/H
12、ej小鼠低于 C57BL/J6小鼠，在股骨 C3H/Hej小鼠的机械力学强度明显高于 C57BL/J6小鼠，而腰椎无明显影响。对比研究C3H/Hej小鼠, C57BL/J6小鼠, DBA/2J小22鼠松质骨和皮质骨的骨形态学、骨机械力学强度，及血清中碱性磷酸酶含量，发现C3H/Hej小鼠在各方面均优于C57BL/J6小鼠和DBA/2J小鼠 23,24。通过对C3H/Hej小鼠和C57BL/J6小鼠分离骨髓细胞进行破骨细胞诱导及破骨 细胞功能检测，发现与C3H/Hej小鼠相比，C57BL/J6 小鼠的骨髓 细胞更容易被诱导 分化为成熟的破骨细胞，骨吸收功能更强。同时对C3H/Hej小鼠与C57B
13、L/J6小鼠的股骨远端松质骨进行组织学研究，发现18上海交通大学医学院博士学位论文C57BL/J6小鼠松 质骨里面的破骨 细胞含量明显高于 C3H/Hej小鼠 25。由此可以看到破骨细胞生成的能力与小鼠的遗传背景有关，因此认为小鼠遗传背景对骨骼系统的影响也许和破骨细胞生成的差别有关。对C3H/Hej小鼠和 C57BL/J6小鼠进行运动刺激后研究皮质骨的力学、形态变化、皮质骨形成率、皮质骨参数及皮质骨形成等，发现C3H/Hej小鼠对于运动力学刺激明显低于C57BL/J6小鼠，说 明小鼠遗传背景同时影响了小鼠骨对于外界机械力学刺激时骨形态、骨机械力学强度的变化 26。通过对C3H/Hej 小鼠及C
14、57BL/J6小鼠及其 杂交一代的小鼠 进行基因组连锁 分析，发现多基因遗传位点控制了骨的代谢，从而造成C3H/Hej小鼠及C57BL/J6小鼠在骨形态学、代谢方面及机械力学之间的差别27。这说明基因的差异性控制了骨的发生，发育及代谢等生理及病理方面的变化。我们对目前实验中所运用的C57BL/J6小鼠, Balb/c小鼠和Kunming小鼠等三种不同品系的小鼠进行的四肢皮质骨及腰椎的松质骨进行骨密度扫描的结果也支持目前的观点，小鼠的遗传背景影响小鼠的骨密度，同时说明我们所运用小鼠在骨的代谢方面可能存在差别。三种小鼠在皮质骨，骨密度的检测结果的顺序是：C57BL/J6小鼠Balb/c小鼠Kunm
15、ing 小鼠。在松 质骨，检测结果的顺序是： Balb/c小鼠 C57BL/J6小鼠Kunming小鼠。 C57BL/J6小鼠、Balb/c小鼠、Kunming小鼠在骨方面的差异也是本研究选择这三种小鼠的原因。目前的研究中，推测小鼠的遗传因素也许会影响到机体对磨损颗粒的反应。本研究通过方便的小鼠体内颅骨磨损颗粒骨溶解模型证实了这一设想7,8。分别在C57BL/J6小鼠，Balb/c小鼠和Kunming 小鼠的颅骨部位植入 UHMWPE颗粒。尽管小鼠模型和真正的人体情况还有比较大的差别，但是小鼠研究的结果可以为进一步的研究提供一定的方向，并一定程度反映出遗传因素对于磨损颗粒诱发假体周围骨溶解无菌
16、性松动的影响。植入UHMWPE颗粒后一周，处死小鼠,取出颅骨进行病理学切片分析。染色分析显示与对照组相比，UHMWPE颗粒在各组小鼠均可以有效的诱发颅骨的骨吸收溶解。磨损颗粒诱发骨破坏严重程度的顺序是: C57BL/J6小鼠Balb/c小鼠Kunming 小鼠。通过TRAP染色来 显示破骨细 胞的存在及 UHMWPE 颗粒诱发的破骨细胞生成。植入19上海交通大学医学院博士学位论文UHMWPE颗粒后，骨溶解破坏区域内的 TRAP阳性 细胞数目与对照组相比有增加。UHMWPE颗粒诱发体内破骨细胞生成数目增加的顺序是 C57BL/J6小鼠Balb/c 小鼠Kunming 小鼠。病理学分析数据显示遗传
17、因素可以影响机体 对于磨损颗粒诱发的局部破骨细胞生成的反应。取出小鼠的颅骨进行器官培养，分析分泌到培养基上清中细胞因子的表达量，了解小鼠对于植入UHMWPE颗粒后炎症反应的差别。结果显示在三种小鼠中，IL-1的分泌量和小鼠的品系有明显关系。在接受UHMWPE颗粒植入的三组小鼠，C57BL/J6小鼠Balb/c 小鼠 Kunming小鼠。 对照组之间无明显 差别。说明小鼠的遗传因素可以明显的影响小鼠对于UHMWPE颗粒体内刺激诱发炎症反应的程度。TNF- 的分泌量和小鼠的品系及颗粒的植入没有明显关系。TNF-在磨损颗粒诱发骨溶解反应中，起来非常重要的作用，根据基因敲除小鼠的研究的结果，通过敲除了
18、小鼠 TNF-的受体后，阻断了 TNF- 的信号传导通路，尽管PMMA颗粒可以诱发明显的炎症反应和细胞因子分泌，但是不能诱发破骨细胞的生成17。同样在小鼠颅骨部位植入纯钛颗粒，然后全身给予TNF- 拮抗剂依那西普(etanercept)治疗或者通过转基因技术局部回植表达抗TNF-融合抗体的细胞，均可以有效的抑制磨损颗粒诱发的小鼠颅骨骨溶解及破骨细胞生成 20,28 。目前小鼠器官培养结果中TNF-的分泌量在植入UHMWPE颗粒的各组小鼠与对照组间没有看到明显差别，这可能和TNF-在磨损颗粒刺激的早期起作用，而发生骨溶解破坏已经是发生在晚期，所以没有观察到表达上的差异。目前的结果和以前的研究结果
19、类似，无论有无颗粒植入，颅骨器官体外培养TNF-分泌的量没有明显差别 29颗粒骨溶解器官培养不是反映TNF-表达量差别的最佳方法。IL-1信号传导在骨的发育 过程中发挥比较重要的作用。另一种可能是小鼠颅骨磨损30。在局部磨损颗粒诱发破骨细胞生成骨溶解的病理过程，IL-1起着非常重要的作用。在 IL-1受体基因敲除小鼠的股骨髓腔内植入钛颗粒和金属棒，野生小鼠假体周围局部有大量的 IL-6和MCP-1（macrophage chemoattractant protein-1，MCP-1 ）表达，而在IL-1受体基因敲除小鼠IL-6和MCP-1的表达量明显减少。组织切片显示，在野生型小鼠，假体周围生成大量的炎性纤维组织膜，而基因敲除小鼠与之相比则不明显，说明 IL-1在磨损颗粒诱发炎性过20
