1、论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载Manuscript paper, has not yet to contribute, network modification, please do not reprint产木聚糖酶芽胞杆菌的筛选及产酶条件优化刘程程 1,2，刘波 1，2* ，蓝江林 2，王凯 3（1. 福建农林大学生命科学院，福州 350003；2 福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州 350003；3. 福州大学生物工程学院，福州 350002）摘要：利用木聚糖酶选择培养基，从 120 株标准芽孢杆菌中筛选出 37 株能够形成明显透明圈的芽孢杆菌。经产酶发酵液培养基复筛，得到一
2、株木聚糖酶活性较高的菌株 FJAT-14260（沙福芽胞杆菌 B. safensis）。采用单因素实验设计和正交实验设计进行优化，在培养基优化中对产酶影响最大的因素是底物浓度， ；在发酵条件优化中对产酶影响最大的因素是培养温度。优化得到 FJAT-14260 的最佳产酶发酵条件为：碳源( 酵母粉)7 g/L,氮源(蛋白胨)9 g/L,底物（木聚糖）浓度为 10 g/L，培养温度 30，初始 PH 值为 8，装液量为 30mL/250mL.在此条件下 FJAT-14260 在发酵 32 h 时酶活力达到 113585.78（U/mL)，比优化前提高了 4.62 倍。关键词：芽胞杆菌 木聚糖酶 发
3、酵条件Screning of a xylanase producing Bacillus sp and the optical condition for xylanase productionAbstract： Selective medium for xylanase was applied to screening the xylanase producing Bacillus strains and 37 of 120 type strains of Genus Bacillus were found to form transparent circle on the plate. A
4、fter secondary screening with the enzyme fermentation medium Bacillus safensis FJAT-14260 was found to be the best strain for xylanase production. Single factor experiment and orthogonal experiment were used to optimize the xylanase production conditions.The results showed that concentration of indu
5、cer was the most important factor wich affect enzyme producing in process of the medium components optimization，and cultural temperature was the most important factor in the process of fermentation conditions optimization. The best enzyme production medium after optimization was consisted of nitroge
6、n source (yeast extract)7g/L, nitrogen source(peptone)9g/L,inducer(xylan)10g/L，then with the best fermentation temperature 30，pH8.0 and liquid volume 30mL/250mL. Under the conditions above, xylanase activity reached 113585.78（U/mL) when FJAT-14260 was fermented for 32h，which was 4.62 folds of that b
7、efor optimization.Key words:Bacillus sp；xylanase；fermentation conditions木聚糖是多聚五碳糖其主链是由 -1, 4 糖苷键将多个 D-木糖残基连接起来的 1，是主要存在于植物细胞壁中的半纤维素成分，在自然界中的含量丰富来源广泛，除纤维素以外，是自然界中最主要的可再生资源多糖 2-3。木聚糖广泛的存在与植物体内，然而在动物的消化道内基本不能被消化吸收，这样会让一些营养物质无法被吸收利用，很强的抗营养性就表现出来，因此限制了很多含有木收稿日期： 修订日期：作者简介：刘程程（1989- ） 。硕士研究生，从事生物技术研究通讯作者：
8、刘波，男，博士、研究员，主要从事农业生物药物研究（E-mail：）基金项目：农业部公益性行业科研专项（201303094 ） ；科技部国际合作科技专项（ 2012DFA31120） ；国家科技支撑计划（2012BAD14B15）;国家自然科学基金（31370059） 论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载Manuscript paper, has not yet to contribute, network modification, please do not reprint聚糖植物饲料在饲料工业和畜牧业生产中的应用 4。木聚糖酶是一类重要的木聚糖甘键水解酶，也是一种诱导酶，主要包括 1,4
9、-木聚糖内切酶、1,4-D 木糖苷酶、 1,4-D 甘露糖苷酶、l,4-D 葡萄糖苷酶、 -L-阿拉伯糖苷酶、-D- 葡萄糖苷酸酶、-D-半乳糖苷酶、脂酶等多种酶组成的复合酶系 5。在这个复合酶中，多种酶协同作用可以把木聚糖降解为低聚木糖和木糖。木聚糖酶来源广泛，在微生物、植物、动物中都有获得，由于动、植物中酶的含量低提取及纯化过程相当复杂，不能满足研究的需要，所以大量木聚糖酶来源于微生物中，有关报道显示在曲霉、木霉、青霉、海枣曲霉、酵母菌、裂褶菌、芽胞杆菌等菌中都能产生木聚糖酶 6。.随着人们对可再生资源利用的重视，木聚糖酶的研究也越来越受人们关注，木聚糖酶的应用行业越来越广泛，在食品、造纸
10、、饲料、保健及能源转化等工业上都有应用 7，因此提高木聚糖酶的单位产量迫在眉睫。国内外关于木聚糖酶的报道很多，但大多数是对霉菌和酵母菌的研究，并且这两种菌产木聚糖酶的发酵周期长、产酶效率低，不利于工业化生产 8,9,10。 根据研究表明细菌自身产木聚糖酶在一些方面比真菌产木聚糖酶有优势，例如：细菌的产酶最适温度与微生物的最适生长温度成正相关；产酶的条件简单易控制；热稳定性好、pH 值稳定 11,12。本文主要是利用芽胞杆菌遗传性稳定、繁殖快、培养条件简单、并且能够大量产酶等优点来研究其产木聚糖酶的发酵条件，为以后的工业生产奠定基础。1 材料与方法1.1 供试菌株芽胞杆菌 125 株，选自福建省
11、农业科学院农业生物资源所菌种库。菌株种名编号表格1.2 试验方法1.2.1 培养基及主要试剂配制木聚糖酶发酵培养基：木聚糖 4.0g（sigma ） 、酵母提取物 5.0 g、NaCl 3.0 g、NH 4NO32.0 g、K 2HPO4 1.0g，MgSO 47H2O 0.5 g、水 1000 mL,pH 7.0。木聚糖固体培养基：木聚糖 5.0 g、琼脂 15-20 g、水 1000 mL， pH 7.0。3%木聚糖底物：称取 3.0 g 木聚糖，以 pH6.6 的磷酸缓冲液 100 ml 加热溶解（现配现用） 。3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：将 6.3 g 3,5-二硝基水杨酸和
12、262 mLNaOH（2 ml/L）溶液，加入到 500 mL 含有 185 g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5 g 结晶酚和 5 g 亚硫酸钠，搅拌溶解冷却后加蒸馏水定容至 1000 mL，贮于棕色瓶备用（7d 后方可用） 13。1.2.2 产木聚糖酶芽胞杆菌的筛选将 125 株实验菌株在 LB 平板上活化，然后接种到产木聚糖酶的发酵培养基中，30下 170r/min震荡培养 2d。 取发酵培养液 2 ml，6000 rpm、4 离心 10 min，取上清液为木聚糖粗酶液备用。用 7 mm 直径的打孔器在木聚糖固体培养基中打三个孔。每个孔中加入 90 ul 粗酶液，置 37 培养 5 h。
13、然后在固体培养基上加入无水乙醇，静置 2-3h。若菌落周围的木聚糖被分解为单糖而出现透明圈 14，则该菌株能产木聚糖酶。采用比值 H/C（H 为透明圈的直径 mm，C 为加样孔直径为 7 mm）初步判断该菌株产生木聚糖酶活性的大小。选取经初步判断具有产木聚糖酶活性的芽胞杆菌，制备种子液，用移液枪吸取 2%种子液加入250 mL 三角瓶装液量为 50 mL 灭菌发酵培养基中。将三角瓶置于 30 、170 rpm 恒温震荡摇床中培养。培养 48 h 后取出，立即取 8 ml 菌液 4、6000 rpm 离心 10 min，收集上清液，适当稀释，以备测定。论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载Man
14、uscript paper, has not yet to contribute, network modification, please do not reprint木聚糖酶酶活力测定(DNS 法）(1)木糖标准曲线的制备 15：分别取标准木糖溶液（ 1.00 mg/ml）0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 均定容至 2 mL，再加入 3 mL 的 DNS 溶液，沸水浴 10 min，然后冷却定容至 20 mL，最后测 540 nm 处吸光度。(2)木聚糖酶活测定方法取 4 支具有 20 mL 刻度的具塞试管，都加入 1 ml 的粗
15、酶液取 1 支在沸水下煮沸 5 min 灭活，然后在 4 支试管中同时加入 1 ml 的 2%的木聚糖底物，50下反应 10 分钟后到沸水浴中煮沸，加入 3 ml DNS 溶液煮沸 10 min 显色，最后定容测 540 nm 下的吸光度。在上述条件下，酶活力单位定义：在 pH 6.6、温度为 50的条件下，每 1 mL 木聚糖酶在 1 min 内催化木聚糖水解生成 1 g 的木糖为一个酶活力单位 U（U/mL） 16。计算公式如下：vtBNUU1 mL 粗酶液的酶活， U/mL；N测试粗酶液稀释倍数；B测定 OD520 值所对应的木糖糖的质量，g。t反应时间 minV粗酶液体积 mL 1.2
16、.3 沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 产木聚糖酶活性发酵条件优化1.2.3.1 生长曲线绘制将高产酶菌株活化后接种在 LB 培养基上，取样时间为 0 h、2 h、4 h24 h，共取样 13 次，测其 OD600 值。每个点测三次求平均值绘制曲线。1.2.3.2 营养条件对沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 产木聚糖酶活性的影响以木聚糖酶液体发酵培养基为基础培养基，分别改变碳源和氮源的种类 17（表 1） ，含量均为5.0 g/L，摇瓶培养 36 h，测定酶活。分别选出最佳碳源和氮源，在不同浓度(3 gL-1、5 gL
17、-1、7 gL-1、 9 gL-1、11 gL-1)下，摇瓶培养 36 h，测定酶活。选择最佳碳源氮源种类的基础上选择最适浓度，然后改变底物浓度 (2 gL-1、5 gL-1、8gL -1、11gL -1、14gL -1) 见表(1)摇瓶培养 36 h，测定酶活。表 1 碳、氮源种类及木聚糖浓度Table 1 The type of carbon and nitrogen source and concentration of xylan项目 A B C D E碳源 麦芽糖 蔗糖 葡萄糖 玉米淀粉 酵母粉氮源 蛋白胨 (NH4)2SO4 牛肉膏 尿素 NH4NO3木聚糖浓度（ gL-1） 2
18、5 8 11 141.2.3.3 沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 产木聚糖酶发酵营养条件正交实验优化在氮源和碳源单因素实验的基础上，选定碳源浓度、氮源浓度、底物浓度 3 个因素，每个因素确定 3 个水平，设计 3 因素 3 水平的正交表 L9(33)同时设置空列。表 2 因素水平表Table 2 The level able of factors蛋白胨不同浓度 蛋白胨不同浓度 酵母粉不同浓度水平A (g/L-1) B (g/L-1) C (g/L-1)论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载Manuscript paper, has not yet to
19、contribute, network modification, please do not reprint1 5 6 72 7 8 93 9 10 111.2.3.4 发酵培养条件对沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 产木聚糖酶活的影响基于以上优化后的培养基，设计不同的培养条件，见表 3。分别测定其单因素条件改变下的酶活。表 3 不同培养条件水平表Table 3 The level table for different culture condition项目 A B C D E温度（） 25 30 35 40 45pH 5 6 7 8 9装液量（ mL
20、） 30 50 70 90 1101.2.3.5 沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 产木聚糖酶活性发酵培养条件正交优化在单因素优化的基础上，设计正交表 L9(33)，测定酶活，确定最佳综合培养条件。以测定最佳培养条件为基础，以 2%的接种量接种进行发酵，取样时间为 0，8 h、16 h、24 h72 h，共取样 9 次，测定酶活。表 4 因素水平表Table 4 Table of factors水平 初始pH值 培养温度() 装液量(mL)1 6 25 302 7 30 503 8 35 702 结果与分析2.1 产木聚糖酶芽胞杆菌的筛选产木聚糖酶芽胞杆菌
21、筛选结果见图 1、表 5。芽胞杆菌菌株 FJAT-10029、FJAT-10006 、FJAT-14261 的 H/C 值最小，为 1.29，初步判断其酶活力最小。芽胞杆菌菌株 FJAT-14260、FJAT-8782、FJAT-8774 H/C 值分别为 4.70、5.01、5.12，明显高于其他 H/C 值，初步确定这三株菌株的酶活力相对较高。进一步复筛结果表明，FJAT-8779、FJAT-14260 产木聚糖酶的能力高，这两株的初筛结果酶活也是相对较高，分别为 18249.82 Uml-1、24597.65 Uml-1；而 FJAT-14260 的酶活显著高于 FJAT-8779，选择
22、FJAT-14260（前期鉴定为沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis）作为目标菌株进行后续研究。论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载Manuscript paper, has not yet to contribute, network modification, please do not reprint菌株 2 菌株 3图 1 FJAT-14260（沙福芽胞杆菌 B. safensis）的透明圈Fig 1.Transparent zone of B. safensis表 5 37 株芽胞杆菌的筛选Table 5 Screen of 37 strains of Bacillus
23、种名 H/C 比值 木聚糖酶活力（Uml -1）菌株编号 H/C 比值 木聚糖酶活力（Uml -1）1学名FJAT-10029 1.58 1.29 20FJAT-10012 3.33 117.12FJAT-10006 1.59 1.29 21FJAT-8764 3.35 129.323FJAT-14261 1.65 1.29 22FJAT-8776 3.37 140.174FJAT-14232 2.01 1.63 23FJAT-8784 3.37 157.185FJAT-10028 2.02 1.97 24FJAT-14215 3.37 258.216FJAT-10055 2.23 4.79
24、25FJAT-10038 3.37 335.577FJAT-8758 2.37 11.95 26FJAT-8757 3.47 351.798FJAT-10058 2.58 15.99 27FJAT-10010 3.48 382.959FJAT-10005 2.75 17.62 28FJAT-8754 3.55 390.2210FJAT-14235 2.77 17.63 29FJAT-8755 3.60 398.8911FJAT-14210 2.79 21.09 30FJAT-8787 3.60 399.7612FJAT-14271 2.95 34.09 31FJAT-8766 3.70 422
25、.213FJAT-10025 3.09 44.27 32FJAT-14251 3.77 437.8214FJAT-8788 3.10 61.15 33FJAT-8779 4.36 505.2815FJAT-8789 3.10 82.9 34FJAT-8783 4.38 518.316FJAT-14213 3.26 88.84 35FJAT-14260 4.70 579.7917FJAT-10009 3.28 97.25 36FJAT-8782 5.01 18249.8218FJAT-10030 3.28 100.54 37FJAT-8774 5.12 24597.6519FJAT-14233
26、3.32 109.62.2 碳源对芽胞杆菌产木糖酶的影响论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载Manuscript paper, has not yet to contribute, network modification, please do not reprint以沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 为例，不同碳源情况下， B. safensis FJAT-14260 产木聚糖酶能力由图 3 可知。B. safensis FJAT-14260 在发酵培养基中以蔗糖和玉米淀粉为碳源时，木聚糖酶活很低，为 520.24 Uml-1；以葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为
27、碳源时，木聚糖酶活也处于很低的水平，分别为 40.31 Uml-1、125.37 Uml-1、776.32 Uml-1；以酵母粉为碳源时，菌株的木聚糖酶活性很高，可达到 28285.25 Uml-1，因此判定该菌株的最适碳源为酵母粉。酵母粉浓度对木聚糖酶活的影响见由图 4 可知。酵母粉浓度为 3 gL-19 gL-1 时木聚糖酶活逐渐增加，浓度达到 9 gL-1 时木聚糖酶活为最大，达到 47167.40 Uml-1，大于 9 gL-1 时木聚糖酶活就开始下降，由此可以得出在单因素改变的情况下酵母粉浓度为 9 gL-1 时木聚糖酶活最高。05105205305酵 母 粉 麦 芽 糖 蔗 糖 葡
28、 萄 糖 玉 米 淀 粉不 同 碳 源(UmL)图 3 不同碳源种类对木聚糖酶活的影响Fig 3 Different types of carbon source on the influence of xylanase activity30540502345678910112(gL)(UmL)图 4 酵母粉浓度对木聚糖酶活的影响Fig 4 Effect of yeast concentration on xylanase activity2.3 氮源对芽胞杆菌产木糖酶的影响以沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 为例，不同氮源情况下， B. safensis
29、 FJAT-14260 产木聚糖酶能力由图 5 可知。B. safensis FJAT-14260 在发酵培养基中以尿素、 NH4NO3 、(NH4) 2SO4、氮源时，木聚糖酶活很低，分别为 28808.74 Uml-1、28285.25 Uml-1、26927.42 Uml-1；以牛肉膏为碳源时，木聚糖酶活为 34894.41Uml-1；以蛋白胨为碳源时，菌株的木聚糖酶活性很高，可达到 39601.11 Uml-1 因论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载Manuscript paper, has not yet to contribute, network modification, p
30、lease do not reprint此判定该菌株的最适氮源为蛋白胨。牛肉膏和蛋白胨属于有机氮，硝酸铵、硫酸铵、尿素属于无机氮，本实验表明使用有机氮木聚糖酶活比使用无机氮有很大的优势，因为有机氮成分复杂，能够为微生物的生长提供更加丰富的营养物质。不同浓度的蛋白胨对木聚糖酶活的影响如图 6 所示：蛋白胨浓度为 3 gL-17 gL-1 时木聚糖酶活逐渐增加，浓度达到 7 gL-1 时木聚糖酶活为最大，达到 41880.11 Uml-1；大于 7 gL-1 时木聚糖酶活就开始下降，由此可以得出在单因素改变的情况下蛋白胨浓度为 7 gL-1 时木聚糖酶活最高0.51.02.530.4.50牛 肉
31、膏 蛋 白 胨 硫 酸 铵 硝 酸 铵 尿 素不 同 氮 源木聚糖酶活力（UmL)图 5 不同氮源对木聚糖酶活的影响Fig 5 Different types of nitrogen source on the influence of xylanase activity3054050234567891012(gL)(UmL)图 6 蛋白胨浓度对木聚糖酶活的影响Fig 6 Effect of peptone concentration on xylanase activity2.4 底物浓度对芽胞杆菌产木糖酶的影响以沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 为例，
32、底物的不同浓度对产酶的影响如图 7 所示：木聚糖浓度为 2 gL-18 gL-1 时木聚糖酶活逐渐增加，大于 8 gL-1 时木聚糖酶活下降。这个实验说明木聚糖酶是一种诱导酶，当木聚糖的量达到一定程度时会出现底物抑制现象，由此可以得出单因素改变的情况下底物浓度为 8 gL-1 时木聚糖酶活最高为 44754.81 Uml-1。论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载Manuscript paper, has not yet to contribute, network modification, please do not reprint10520354050612345678910123145
33、(gL)(UmL)图 7 底物浓度对木聚糖酶活的影响Fig 7 Effect of inducer concentration on xylanase activity2.5 芽胞杆菌产木聚糖酶发酵营养条件优化以沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 为例，根据碳源、氮源、 底物单因素实验结果，选取每个因素合适的水平进行正交实验，正交实验结果如表 3。表 6 正交实验结果Table 6 The result of orthogonal experiment蛋白胨不同浓度 底物不同浓度 酵母粉不同浓度水平 A(gL-1) B(gL-1) C(gL-1) 酶活力(U
34、mL-1)酶活力(UmL-1)酶活力(UmL-1)1 5 6 7 58662.25 65620.11 62555.262 5 8 9 74216.33 75740.32 73200.613 5 10 11 69241.34 65655.21 65090.214 7 6 9 55972.28 52420.32 56125.655 7 8 11 56073.52 60570.81 53300.436 7 10 7 83086.47 80755.12 82220.297 9 6 11 52904.49 55845.16 58640.458 9 8 7 78403.13 77955.43 80870.
35、269 9 10 9 71121.42 70080.54 75140.47K1 609981.64 518745.97 670128.32K2 580524.89 630330.84 604017.94K3 620961.35 662391.07 537321.62k1 203327.21 172915.32 223376.11k2 193508.30 210110.28 201339.31k3 206987.12 220797.02 179107.21R 40436.46 143645.1 132806.7表 7 正交实验方差分析结果Table 7 The result of varianc
36、e analysis on orthogonal experiment因素 平方和 自由度 均方 F值 p-值 第1列 97161535.17 2 48580767.58 2.8873 不显著第2列 1263442826 2 631721413.2 37.5455 极显著第3列 979874111.5 2 489937055.7 29.1187 极显著合并误差 336510231.7 20 16825511.58论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载Manuscript paper, has not yet to contribute, network modification, please
37、 do not reprint极差 R 分析结果显示，各因素影响菌株 B. safensis FJAT-14260 产木聚糖酶的主次因素为BCA，多个方面分析得到产酶的最佳培养基组合为 B3C1A3。在正交表中没有这个处理组合，所以需要验证这个组合的可行度。经过试验验证这个培养基组合的酶活值比正交表中产酶最高的酶活值都高。所以通过本次试验确定 B. safensis FJAT-14260 的最佳发酵培养基为 底物浓度 10 gL-1、酵母粉浓度 7 gL-1、蛋白胨浓度 9 gL-1、 NaCl 3.0 g、K 2HPO4 1.0g，MgSO 47H2O 0.5 g。2.6 温度对芽胞杆菌产木
38、聚糖酶活性的影响以沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 为例，利用最优发酵液培养基，不同培养温度的改变对产酶的影响如图 8 所示：培养温度为 30时木聚糖酶活力最大为 87380.25 Uml-1，当培养温度为 35、40、45 时木聚糖酶活处在很低的水平。304560789012253035404550(UL)图 8 培养温度对木聚糖酶活的影响Fig 8 Effect of temperature on xylanase activity2.7 初始 PH 值对芽胞杆菌产木聚糖酶活性的影响以沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-1426
39、0 为例，利用最优发酵液培养基，不同初始 PH 值的改变对产酶的影响如图 9 所示：初始 PH 值为 57 时木聚糖酶活力逐渐增加，酶活力的增加并不是很明显，当 PH 值 89 时酶活力逐渐下降，并且下降趋势显著，强碱性的环境可能会影响产酶的量，所以只在单因素改变的情况下最适初始 PH 值为 7，此时木聚糖酶活力为 87380.25 Uml-1。40.5.60.7.80.9.45678910PH(UL)图 9 初始 PH 值对木聚糖酶活的影响Fig 9 Effect of initial PH on xylanase activity论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载Manuscript
40、paper, has not yet to contribute, network modification, please do not reprint2.8 通气量对芽胞杆菌产木聚糖酶活性的影响以沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 为例，利用最优发酵液培养基，装液量的改变对产酶的影响如图 10 所示：在 250 mL 三角瓶中装液量为 50 mL 时酶活力最高为 87380.25 Uml-1，此时为最适装液量。当装液量为 30 mL50 mL 时木聚糖酶活逐渐增加，当大于 50 mL 装液量时由于液体太多，溶氧不足导致微生物生长缓慢，代谢异常，阻碍产酶。
41、 0.12.304.560.78.901. 2040608010120mL)(UL)图 10 装液量对木聚糖酶活的影响Fig 9 Effect of liquid volume on xylanase activity2.9 芽胞杆菌产木聚糖酶培养条件优化以沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 为例，根据培养温度、初始 PH 值、装液量单因素实验结果，选取每个因素合适的水平进行正交实验，正交实验结果如表 4。表 8 正交实验结果Table 4 The result of orthogonal experiment初始PH值 培养温度 装液量处理号A组 B组(
42、) C组(mL)酶活力(UmL-1) 酶活力(UmL-1) 酶活力(UmL -1)1 6 25 30 81812.08 92990.31 73921.382 6 30 50 72311.71 83564.5 85115.053 6 35 70 36413.12 47054.44 46636.314 7 25 70 29500.37 30947.05 28899.015 7 30 30 90775.54 110179 102780.46 7 35 50 63161.82 84459.36 83173.547 8 25 50 59276.66 71580.91 67633.438 8 30 70
43、49895.60 56152.13 56623.529 8 35 30 89030.57 96129.75 78998.1K1 619818.90 536561.20 642189.74K2 623876.09 707397.45 594496.11K3 625320.67 625057.01 632329.81k1 206606.30 178853.73 214063.25k2 207958.70 235799.15 198165.37k3 208440.22 208352.34 210776.60R 5501.77 170836.25 47693.63论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载
44、Manuscript paper, has not yet to contribute, network modification, please do not reprint表 9 正交实验方差分析结果Table 4 The result of variance analysis on orthogonal experiment因素 平方和 自由度 均方 F值 p值 第1列 1808039.82 2 904019.91 0.0149 0.9852第2列 1622091880.04 2 811045940.02 13.4122 0.0003第3列 140862571.03 2 70431285
45、.52 1.1647 0.3344重复误差 1088471391.07 18 60470632.84极差 R 分析结果显示，各因素影响菌株 FJAT-14260（沙福芽胞杆菌 B. safensis）产木聚糖酶的主次因素为 BAC，多个方面分析得到产酶的最佳培养基组合为 B2A3C1。在正交表中没有这个处理组合，所以需要验证这个组合的可行度。经过试验验证这个培养基组合的酶活值比正交表中产酶最高的酶活值都高。所以通过本次试验确定 FJAT-14260（沙福芽胞杆菌 B. safensis）的最佳发酵条件为培养温度 30、初始 PH 值 8、装液量为 30 mL。2.10 发酵时间对芽胞杆菌产木糖
46、酶的影响以沙福芽胞杆菌 Bacillus safensis FJAT-14260 为例，基于以上最优发酵条件，每 8 h 取样跟踪 B. Safensis FJAT-14260 的生长曲线和产酶曲线如图 11 所示：在 24 h 时 OD 值进入稳定期，8 h32 h 之间酶活迅速增加，到 32 h 达到最高为 113585.78(UmL-1)，然后逐渐达到一个稳定的状态。0.240.680.120.8162434085647280. 51.0 52.0 53.0 5培 养 时 间 (h)木聚糖酶活力(UmL-) OD值木 聚 糖 酶 活 力 （ UmL-1OD值图 11 不同发酵时间产酶曲线
47、和生长曲线3 讨论针对每个研究小点，用文献讨论本文主要是通过初筛、复筛得到一株木聚糖酶活较高的菌株 FJAT-14260（沙福芽胞杆菌 B. Safensis)，并且通过单因素实验设计和正交实验设计对 FJAT-14260(沙福芽胞杆菌 B. Safensis)进行发酵条件优化。最后优化结果为：碳源(酵母粉)7 g/L,氮源(蛋白胨 )9 g/L,底物（木聚糖）浓度为 10 g/L，培养温度 30 ，初始 pH 值为 8，装液量为 30mL/250mL.在此条件下 FJAT-14260 在发酵 32 h 时酶活力达到 113585.78（U/mL)，比优化前提高了 4.62 倍。孙振涛等从土壤
48、中筛选出一株坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)xy-7，发酵优化后酶活达到 167.9 U/ml18；包怡红等（2008 年）在土壤中论文手稿，尚未投稿，网络修改，请勿转载Manuscript paper, has not yet to contribute, network modification, please do not reprint筛选出一株类芽孢杆菌(Paenibacillus.sp)，优化后酶活达到 194.67 U/ml19。单春乔等从新鲜瘤胃内容物中筛选出一株芽胞杆菌，其酶活力为 2565 U/ml20；李蕤等从安徽省霍山县某堆肥
49、中分离纯化出一株芽胞杆菌 HSI，优化后酶活达 54 U/ml。与其他有关芽胞杆菌产木聚糖的报道相比，FJAT-14260（沙福芽胞杆菌 B. Safensis)产木聚糖酶活高，培养条件简单，且国内目前为止尚未见对沙福芽胞杆菌产木聚糖酶的报道，但是由于培养基成本偏高、若要工业生产还需要进一步研究。参考文献1 Song Y, Lee Y G, Choi I S, et al. Heterologous expression of en-do-1, 4- -xylanase A from Schizophyllum commune in Pichia pastoris and functional characterization of the recombinant enzy
