1、 中国水仙花色苷合成途径基因的表达及导入:MYB 基因研究第一章前言由于漳州水仙是三倍体，长期的栽培过程中都以小鳞茎进行无性繁殖，所以导致现在的水仙球品质有逐年退化的趋势，并且中国水仙花色单一，这些都越来越大地影响了水仙的商品化生产。近年来人们充分利用了我国已有的水仙资源优势，应用各种研究手段来提高水仙的产量和改良水仙品种，从而提高中国水仙产业在国内外的发展。目前中国水仙的研究主要集中在组织培养快繁技术方面2-5，在育种方面相对滞后，尤其是花色理论研究方面，尚未完全解释清楚其呈色的基本机理。本试验将通过对中国水仙花色苷途径相关基因表达分析，利用转基因技术导入外源转录调控因子，进而揭示水仙花的花
2、色苷途径调控机制，为最终全面掌握水仙花显色机理和获得新品种打下良好的基础。1.植物花色素苷研究进展花色素苷(anthocyanidin) 是花色素(anthocyanin)与各种单糖通过糖普键结合形成的糖基化衍生物的总称，是类黄酮 flavonoids）的一个亚类，广泛存在于开花植物(被子植物)中。花色素苷是植物中最重要的、分布最广泛的一类有色物质，是植物花、叶、果实和种子中几乎所有颜色的物质基础，形成了植物各种各样的颜色，从红色、蓝色到紫色等6-7。由于花色素苷以糖苷形式存在，极易溶于水，易在液泡中积累，可明显减弱可见光辐射，因此，花色素也具有提高光保护力8、提高抗冻和抗旱力9-10、提高植
3、物繁殖力11、提高抗氧化力等主要功能，也被视为一种有效而广谱性的保护因子。1.1 花色苷生物合成途径类黄酮类化合物包括花色苷和其它黄酮类色素化合物，是植物中一大类次生代谢产物，因此类黄酮次生代谢途径是目前研究得较清楚的代谢途径之一，其中花色苷的生物合成途径则是该途径中目前研究得最多最清楚的11-12，特别在主要模式植物中已经很清晰，如玉米、矮牵牛13和拟南芥14 。花色苷的合成从苯丙氨酸和脂肪酸合成代谢合成丙二酰 CoA 这步开始，经苯丙烷类代谢途径合成13。其中可以分成 3 个阶段：1）由苯丙氨酸到香豆酰 CoA，这是整个类黄酮代谢共有反应；2）由香豆酰 CoA 到二氢黄酮醇，这是整个类黄酮
4、代谢的关键反应步骤，它合成各种花青素和其它黄酮类物质。根据不同植物中 F3H、F3H 和 F35H 的底物特异性和酶活性的差异，导致了 DHK，DHQ 和 DHM 合成量的差异，从而最终形成不同的花色素；3）是各种花色素苷的合成。无色的二氢黄酮醇 DHK、DHQ、DHM 分别合成天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素，再经氧化、脱水、甲基化、糖苷化分别合成天竺葵色素苷砖红色）、矢车菊色素苷红色）、飞燕草色素苷蓝紫色）的衍生物。随着现代分子生物学技术的发展以及对植物类花色苷途径机理研究的深入，发现了众多参与类黄酮类代谢或花色苷合成途径的基因，从功能上将其分为两类，一类是结构基因，即编码可以直接参与花
5、色苷形成的酶的基因，如：查尔酮合成酶基因(CHS)、查尔酮异构酶基因 CHI）、二氢黄酮醇 4-还原酶基因(DFR)、黄烷酮 3-羟化酶基因(F3H)和花色素合成酶基因 (ANS)等；另一类是调控基因，即不直接参与花色苷的形成，但它们表达的蛋白可以调控结构基因表达，如MYB、bHLH 和 WD40 等转录因子，这些转录因子调控花色苷生物合成中结构基因的表达强度和模式，同时控制花色苷在时空上的变化，因此花色苷的合成是由多基因参与和多代谢途径控制的代谢过程。1.2 花色苷生物合成途径中的结构基因1.2.1 查尔酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)CHS 是进入类黄酮和花色苷次生代
6、谢的第一个关键酶基因，属于植物型聚酮合成酶的一种15，它催化三分子的丙二酰-CoA 和一分子的肉桂酰-CoA 合成四羟基查尔酮，也是第一个被克隆出的类黄酮次生代谢途径的关键酶基因。CHS 基因在多种植物中都是一个多基因家族，其表达受到很多内外因素的调控，基因结构也非常保守16。典型的 CHS 为多酮酸合酶，可以是多功能或单功能的蛋白17。目前已从多种植物中获得 CHS 基因。虽然 CHS 基因序列的同源性很高，但在功能上存在明显差异。同一植物体内也存在多个 CHS 基因拷贝，而在不同部位中的表达活性不同。矮牵牛的 CHS 基因家族共有 12 个，彼此有 80%的同源性，但是只有两个(CHSA
7、和 CHSJ)能够在花粉囊和花冠中表达18 。在苹果属观赏海棠中，紫色的王族幼叶 McCHS 基因的表达量明显高于绿色的火焰幼叶19。此外，CHS 基因也受环境胁迫的诱导，例如微生物病原菌、伤害、紫外辐射、真菌来源的多糖诱导子等逆境环境都能诱导 CHS 基因的表达20 。在改良植物花色研究过程中，CHS 基因的转基因研究也得到了广泛的开展。Ken-ichi Suzuki 等21将 CHS 基因转入蓝色夏蓳中, 使花瓣部分花色由蓝色变为白色；Kose 等22发现矮牵牛 Red Star 花色苷生物合成途径中的重要基因，只有 CHS 基因的表达受到抑制从而使花冠形成红白相间的现象；祝钦拢23将彩叶
8、草 CHS 基因转入烟草中，烟草叶片出现了色斑；此外，在菊花、月季、香石竹等中都采用过量表达 CHS 基因的方法得到粉色或白色的转基因植株24。第二章中国水仙花色苷合成途径基因的克隆与表达研究张慧平1的研究表明，中国水仙花色素的主要成分是叶黄素和 -胡萝卜素，并且类胡萝卜素代谢途径相关基因大部分已经在中国水仙中克隆出来，中国水仙花色的研究重点在类胡萝卜素代谢途径，而花色苷代谢途径的基因才刚刚被开始克隆。本章克隆水仙花色苷代谢途径的关键基因 DFR、ANS 、FLS 保守区序列，通过 RT-PCR 检测 CHS、CHI、F3H、DFR 、ANS、FLS 在中国水仙花瓣和副冠不同时期的表达情况，探
9、索中国水仙花花色苷代谢机制。1.材料与方法ANS 是花色苷生物合成途径后期表达的第二个关键酶，催化无色的原花色素氧化产生有色的花色素，对最后植物颜色的形成至关重要。ANS 基因在多种植物中都已被克隆出来并进行了结构和表达研究。大部分 ANS 基因的结构包含 2 个外显子和 1 个内含子，且剪接位点一致，为单拷贝或者小基因家族。在草莓上通过抑制 ANS 基因的表达量，使花青苷的积累明显减少，花冠由粉红色变为白色46 。连翘在单独转化金鱼草 DFR 或紫罗兰 ANS 同源基因后，花色没有明显改变，但将这两个基因共同导入后与对照相比产生了较大的差异，连翘的花色变成了新异的橙色47。在苹果属观赏海棠上
10、，McANS 基因的表达与花色苷的积累呈正相关，但与类黄酮的含量不成相关性48。从而分别生成山奈素、棚皮素和杨梅素，而 FLS 与 DFR 竞争共同的底物二氢黄酮醇。将矮牵牛的反义 FLS 基因导入烟草中可以使得花青素含量提高49 ；在矮牵牛、康乃馨和紫罗兰的无色花中，随着花青素的生成，FLS 的活性就迅速降低，而在前期 FLS 基因活性很高50。白色矮牵牛品种中正义导入 DFR 或者反义 FLS 导入表达都可以使部分转基因植株的花色变成了粉红色51。第三章 MYB 基因的克隆. 35-381. 材料与方法 35-361.1 材料 351.2 方法 35-362. 结果与分析 362.1 To
11、tal RNA 的提取与纯度检测 362.2 MYB 基因的扩增结果 363. 讨论 36-38第四章 基因枪法介导MYB 在中国水仙花中.38-451. 材料与方法 38-411.1 材料 381.1.1 植物材料 381.1.2 菌株和载体 381.1.3 仪器和设备 381.1.4 主要试剂 381.2 方法 38-412. 结果与分析 41-442.1 pC1301-MYB 表达载体的构建 41-422.2 pC1301-MYB 质粒 DNA 的提取 42-432.3 转化组织的观察 43-443. 讨论 44-451. 利用同源克隆得到了 DFR、ANS、FLS 的保守区。利用半定量
12、 RT-PCR 研究了 CHS、CHI、F3H、DFR、ANS 、FLS 在中国水仙不同花发育时期和不同部位表达情况，目前初步推定 CHI、DFR、FLS 是控制中国水仙花色苷代谢途径的关键基因，CHI、DFR 在花发育前期的不表达是中国水仙花不含花青素类物质的关键原因。2. 改良 Trizol 法可以很好的进行 植物花芽 RNA 的提取，获得较高质量的 RNA，利于后续步骤的试验。3. 本试验将 pC1301 载体中的 GUS 基因切除，导入 MYB 基因，成功构建了植物表达载体 pC1301-MYB。利用基因枪法将 MYB 导入中国水仙花瓣和副冠中，产生了红色斑点，证明外源调控因子 MYB 对水仙花色苷代谢途径产生了影响，使得花青素类物质积累，产生了颜色变化，也证明了中国水仙基因组中存在花色素苷合成相关的结构基因4. 农杆菌法介导 MYB 进行了水仙花葶的遗传转化，利用已优化好的体系，获得了抗性小鳞茎，目前正在壮苗和生根阶段。
