1、核酸荧光染色技术在血液分析仪的最新应用,希森美康医用电子（上海）有限公司,一.概 述,技术：电阻抗、光散射、高频波、化学染色、及流式细胞术。目的：精确定量检测白细胞的五种亚型。,1.五分类与三分类的主要区别：,鞘流,CELLPACK,CELLPACK,样本,半导体激光,激光波长: 633nm,2.半导体激光流式细胞,半导体激光流式细胞,半导体激光+流式细胞,半导体激光提供的细胞信息,前向散射光(FSC)：反映细胞大小。 侧向散射光(SSC)：反映细胞的内容物如核和颗粒。 侧向荧光(SFL)：反映细胞内DNA、RNA的含量。,3.高端机的作用,普通机对异常标本报警的灵敏度有限，常漏报。 为了提高
2、灵敏度，降低报警阈值，导致假阳性率升高。 致力于高灵敏度地检测粒细胞的幼稚、异常成分。,1.白细胞系统,2.红细胞、血小板系统,检测网织红细胞和有核红细胞，并能对网织红细胞的成熟度进一步分类。 对于存在巨大血小板、血小板聚集、小红细胞或细胞碎片的样本，采用核酸染色加光学流式原理能准确检测血小板。,二.核酸荧光染色加流式 白细胞分类原理及临床应用,细胞浆的组成,核糖体：RNA占60%，PRO占40% 线粒体 内质网 高尔基体与中心粒 微管 微丝 溶酶体,细胞核的组成,核膜：胞浆中内质网的延伸。核孔是核浆与胞浆交流及RNA进入胞浆的通道。 核染色质：由DNA、组蛋白、非组蛋白组成。 核仁：核仁丝与
3、颗粒成分含RNA,核仁染色质含DNA。 核浆：是细胞核体积随细胞成熟而变小的原因。,细胞发育成熟的变化,细胞越幼稚，细胞核越大。 细胞越幼稚，核染色质越疏松细致，核仁越明显。 越幼稚细胞浆越少，瑞氏染色着色越深，表明浆内RNA含量越高。,1.DIFF 检测通道,检测参数 Lymphocytes Monocytes Eosinophils Neutrophils,+ Basophils other,溶解 (WBC membrane is weakly damaged),染色 RNA DNA,DIFF 试剂作用示意图,Blast, IG.,Abnormal Lymph , etc.,高荧光信号,低
4、荧光信号,高荧光信号,Normal Cell,正常DIFF与BASO散点图,有核细胞在4DIFF散点图上的分布,4DIFF散点图,2. WBC/Baso 检测通道,检测参数WBCBasophil,BASO 试剂作用示意图,BASO,other WBC,RBC,Hemolysed (Acid, hypotonic solution),WBC/BASO-散点图,Side Scatter (Internal structure),Forward Scatter(Volume),BASO,WBC,成人T细胞白血病（ATL）：,与人类T淋巴细胞病毒型(HTLV- )相关的疾病。 CD4+的细胞是HTLV
5、- 和HTLV- 主要侵袭的细胞，是此类病毒的受体。 其免疫表型：T细胞成熟标志： CD4+ CD3+ CD2+ CD6+ T细胞活化标志： CD25(IL2受体链)+,实例分析,外周血中可出现多形淋巴细胞:淋巴细胞大小不等，核染色质中等致密，核仁模糊不清，核明显不规则，呈多形性改变，扭曲、畸形或呈分叶状，核凹陷很深，呈二叶或多叶，或呈棒球状、手套状或折叠为花瓣状，故也称花细胞。形成原因：机体在某些因素的作用下，细胞的增殖紊乱，失去控制，由二极有丝分裂转变为三极或多极分裂；可有不对称的核分裂，分裂后形态奇异。,ATL,大颗粒型淋巴细胞白血病(LGLL),正常人血象中的颗粒型淋巴细胞属大淋巴细胞
6、，大部分为NK细胞，部分为T细胞。 LGLL：T-LGLL与NK-LGLL 颗粒性原幼淋巴细胞胞浆在瑞氏染色中常染成蓝色，胞浆中出现515粒清晰的粗大的颗粒。 诊断标准：骨髓中颗粒性原幼淋巴细胞应: 5% ，一般10% 。,LGLL,N-T-ALL,N-T-ALL通常为B淋巴细胞系统白血病，极少为起源于淋巴干细胞或性质不明。 分型：型：无标志型 型：普通型型：前B细胞型 型：B细胞型 主要表型标志：HLA-DR、CD19、CD20、CD10的表达不同。,B-ALL,CML急变,AML-M2,AML-M3,AML-M4,M5b,三.核酸荧光染色检测网织红细胞参数原理及临床应用,RET 检测通道检
7、测参数,RET IRF LFR MFR HFR PLT-O,RET 试剂作用示意图,染色: Ploymethine: RNA Oxazine: DNA,RET,WBC,RBC,高荧光信号,很低荧光信号,非常强的荧光信号,Fluorescence(RNA),RET散点图,IRF,IRF,网织红细胞散点图,IRF是评价肿瘤化疗后骨髓造血功能受抑和开始恢复的较敏感的指标。较RET#达到正常参考范围低限要早14天。,网织红细胞参数检测的临床意义,Mugurama应用R-1000对27例白血病和淋巴瘤病人，在化疗期间作了网红各参数的系统观察。 发现有14例在化疗开始时，HFR+MFR的降低早于中性粒细胞
8、和血小板。 有37.2%的病例HFR+MFR与其它参数同时降低。 在骨髓恢复时，52.8%的病例HFR或MFR迅速升高，HFR+MFR与WBC、PLT同时升高的仅占25%。,Kageoka等利用Sysmes R-1000分析了骨髓和外周血中网红与造血状态的关系，发现外周血网红计数用于分析骨髓造血状态优于白细胞计数和血小板计数，化疗后骨髓造血功能从抑制到恢复时，末梢血中HFR的增高较WBC的增加早数天。,外周血造血干细胞移植后病人的IRF%升高提示有较多未成熟细胞从骨髓进入外周血，表明该病人骨髓的造血功能已开始恢复。 从我们观察的病例可以看出，移植后IRF在一定时间内可以出现并升高，则病人死亡率
9、为零。 因此我们认为IRF的变化较网织红细胞总数变化具有更重要意义，IRF%的变化可作为评价肿瘤病人化疗或外周血干细胞移植过程中骨髓造血功能受抑和开始恢复的较敏感指标。,四.核酸荧光染色加流式检测有核红细胞原理及临床应用,NRBC 试剂作用示意图,WBC,NRBC,RBC,高荧光信号 体积：大,低荧光信号 体积: 小,弱荧光信号 体积: 很小,溶血 (WBC membrane is weakly damaged),染色 RNA DNA,NRBC散点图,Forward Scatter(Volume),RBC Ghost,NRBC,WBC,Fluorescence,NRBC 散点图,NRBC散点图
10、,WBC区域,NRBC区域,红细胞碎片,低值CV为3.42 中值CV为1.64% 高值CV为1.39% 该精密度水平超过了NCCL对血液分析仪进行细胞计数的精密度要求3。,检测NRBC的高精密度,2.NRBC?原理,2.有核红警号（NRBC?）性能评价,检测灵敏度为94.3% 检测特异性为97.8% 阳性预期值为76.7% 阴性预期值为99.6% 检测总有效率为97.6%,警号“NRBC?”假阳性率为23.3，其可能的原因有： XE-2100每个NRBC测试需分析10,000个以上的有核细胞，而血涂片法仅检测200个有核细胞。 血液标本中可能存在死亡的小淋巴细胞，其体积及荧光强度与NRBC的裸
11、核相近。,警号“NRBC?”假阴性率为0.44%。 其可能原因为：漏检测的NRBC均为嗜碱性NRBC，其胞浆着色偏蓝，表明该细胞浆内核酸含量较高，因此在白细胞分类散点图上可能出现在淋巴细胞区域。,有核红细胞检测的临床意义,NRBC只有在异常情况下才会出现在外周血循环中 非正常生理情况（早产儿） 强烈促红细胞生成素刺激 造血功能严重不全 以及组织缺氧状态 确保白细胞计数的准确,五.核酸荧光染色加流式检测血小板的原理及临床应用,光学法血小板检测原理,在激光流式通道内，663nm波长的激光照射细胞，用流式细胞方法绘出前向散射光（FSC）和侧向荧光（SFL）。在血小板散点图，血小板体积较红细胞小，分布
12、在红细胞下方，血小板内含极少量的核酸，侧向荧光的强度较成熟红细胞稍大。,PLT-O 散点图,PLT-O,PLT-O,Sysmex XE-2100阻抗法、光学法计数血小板与红细胞/血小板比率法的比较研究,引言,准确计数血小板在血小板减少性疾病的诊断和治疗过程中非常重要。 Sysmex XE-2100血液分析仪：阻抗法 血小板(PLT-I)光学法 血小板(PLT-O) 国际血液学标准化委员会(ICSH)和国际实验血液学委员会(ISLH)推荐方法：红细胞/血小板比率法血小板(PLT-R),实验仪器与原理,一.血液分析仪,Sysmex XE-2100全自动血液分析仪,1,2,3,4,5,6,7,8,9
13、,10,11,12,13,14,Cumulative Size Distribution Curve,Pulse Picture,10,20,30,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,4,1,0,0,0,1,2,3,4,5,4,3,2,1,1.电阻抗法原理,Histogram,2.报警信号的类型及含义,类 型 含 义 检测通道Abn Dst 血小板分布异常 血小板PLT Clumps 血小板聚集 白细胞分类网织红细胞PLT Clumps（S）血小板聚集 血小板,PLT-I,Report,PLT-O,3.PLT-I 和 PLT-O 转换规则,二.流式细胞仪,美国BD
14、公司生产的FACS-Calibur流式细胞仪,1.试剂,pH7.4PBS缓冲液 藻红蛋白标记的单克隆抗体(CD41-PE） 异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体(CD61-FITC）,2.红细胞/血小板比率法原理,PLT-R= RBC-I/（RBC/PLT）106/L,以FCS、SSC设门 以CD61、CD41设门 以CD61、CD41对R1设门,RBC+LPLT,PLT,RBC+LPLT,LPLT,实验方法,1.XE-2100样本检测,用CBC+DIF+RET模式进行血常规检测。实验参数：1.RBC-I2.PLT-I3.PLT-O,1. 10l PBS加于Faclon管 2. 5l CD41-PE
15、 3. 5l CD61-FITC 4. 1l EDTAK2抗凝全血 5. 混匀后放于20-25暗箱孵育15分钟 6. 500l pH7.4PBS 7. 计算出RBC/PLT-R,2. FCM检测,3.批内精密度试验,取无血小板报警信号的三份新鲜全血样本，血小板数分别在低值、正常值和高值范围，分别用三种方法连续测试11次。,4.相关性试验,A组(20例)： no flag B组(20例)： PLT Clumps或PLT Clumps（S）,Abn Dst C组(11例)： Abn Dst,A组：no flag,B组：PLT Clumps, Abn Dst,C组：Abn Dst,结 果,1.精密度
16、试验,批内精密度（n=8）参数 低值 正常值 高值 （109/L） X SD CV X SD CV X SD CVPLT（I） 86 1.77 2.06 151 2.88 1.99 484 4.60 0.95PLT（O） 90 2.44 2.71 144 3.93 2.73 445 6.19 1.38PLT（R） 90 1.87 2.08 148 2.61 1.76 456 4.22 0.93,2.相关性试验,表3. 各光学法与比率法相关性试验结果组别 钭率 截距 R2 PA组 1.0315 12.957 0.9846 P0.001B组 1.1939 14.185 0.9011 P0.001C
17、组 1.0056 -0.7843 0.9934 P0.001表4. 各组阻抗法与比率法相关性试验结果组别 钭率 截距 R2 PA组 1.0774 5.1141 0.9093 P0.001B组 1.0322 12.547 0.9599 P0.001 C组 0.7821 9.015 0.1542 P0.05,A组,B组,C组,讨 论,由于血小板体积小，无色，易粘附，易聚集，因此要准确计数外周血中的血小板确非易事。 从我们的研究结果可以看出，无警号组阻抗法与比率法、光学法与比率法间均有很好的相关性（P0.001）。,1.无警号组,利用阻抗法原理计数血小板的血液分析仪，对于形态正常的血液标本，结果比较
18、可靠。 而光学法计数血小板的批内精密度要低于阻抗法与比率法，这与文献报道一致。,从我们的研究结果可以看出，出现血小板聚集警号的样本组，两方法与参考方法间也有显著相关性。,2.出现血小板聚集警号组,原因： 1.采用浮动界标技术，2-6 fl与1230fl间设置浮动辨别线（LD）和（UD）。 2.可能与统计样本总体血小板数较高有关。,外周血涂片中可见血小板聚集,3.仅出现Abn Dst警号组,我们选择了仅出现血小板直方图异常警号的12例样本，其血小板数均低于60109/L，其血小板直方图显示有较多的巨大血小板存在，其中11例为特发性血小板减少性紫癜病人，1例为巨大血小板综合症病人，光学法与比率法间
19、有显著相关，而阻抗法与比率法间无相关性。,ITP病人外周血涂片中可见巨大血小板,原因：仪器将在2fL至30fL范围内的颗粒定义为血小板，因此当血小板颗粒大于30fL时，仪器就将其归为红细胞。,PLT-O,用流式细胞仪计数血小板时，仅用CD-41单抗或CD-61单抗，血小板数有差异的占73.8%（48/65），因此ICSH、ISLH推荐的方法为两者同时使用。 在检测过程中，我们认为有两点需要特别重视：样本检测时，荧光抗体的量必须合适，如果荧光抗体的量过剩，则容易与其他微粒结合或形成免疫复合物。如果样本中存在较多的白细胞碎片，会对血小板计数造成干扰。,常规大批量样本检测，可用阻抗法。 对阻抗法结果低于正常，且仅出现“血小板分布异常”警号的样本，可用激光染色法复查。 电阻抗法同时出现“血小板聚集”及“血小板分布异常”警号的样本，血小板数在正常范围时,不必用其他方法复检。,4.结论,用以检测不成熟细胞 高度敏感性-幼稚细胞敏感度可达1 提高了血液分析仪的筛选能力 可有效发现 HPC 幼稚细胞 不成熟细胞 核左移 血小板聚集,独立的IMI检测通道,HPC检测,造血祖细胞（HPC）定量分析，与CD34有良好相关 只需40秒就可得到结果 应用于血液肿瘤疾病的治疗 末梢血干细胞移植中，了解最佳捕获时间,谢谢！,
