1、结核及耐药结核自动化检测技术,2018年9月,2014年全球结核发病率,来源：WHO 2015年工作报告,2014年中国新发病例：826155 2014年中国结核发病率：68/100 000 近几年我国结核发病率逐年下降，但仍然属于结核高负担国家,2014年全球耐药结核发病率,来源：WHO 2015年工作报告,新发结核病例中的耐药结核比例,WHO估算2014年中国耐药结核发病数 新发病例：43000 复发病例：8200,我国属于耐药结核 高负担国家,高负担国家的耐药结核发现,我国当前耐药结核防控的问题： 不充分的耐药病人发现，不充足的耐药病人治疗,5.56% 纳入治疗,结核诊治出现偏差！ 过多
2、依赖X-光片或其他影像学检查，忽略了以痰标本为基础的微生物诊断 过多依赖未经验证、或不能作为诊断依据的测试，比如血清学检查 只参考传统的微生物检测结果因为这些检测的不可靠性，WHO 不得不采取非常规手段，特别提出反对这些测试的建议,全球结核控制不理想的问题出在哪里？,结核诊断的常见技术,依据抗酸染色为基础的结核初筛的不可靠性 敏感性为50% 结核/非结核分枝杆菌不能区分（NTM可能占到40%）以培养为基础的结核确诊和药敏对治疗的影响 2个月才获得药敏结果，导致患者脱落 2个月后调整治疗方案，导致耐药患者的漏诊和传播无法更早确诊耐药结核患者,当前临床诊治的难点,结核诊断新技术,IGRA T-Sp
3、ot QuantiFeron NAAT技术 等温扩增检测技术 线性探针 基因芯片 熔解曲线 巢式PCR 血清学检测,IGRA,原理：机体感染过结核分枝杆菌，T-淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌时，产生和分泌特异性的细胞因子IFN-,操作步骤： 反转10次混匀 37C条件下孵育16-24小时 2000-3000g离心15分钟 用移液管取血浆 每个孔内放50ul结合液 加入50ul血浆，室温孵育120分钟 洗板至少6次 每个孔内加100ul底物，室温孵育30分钟 加入50ul反应终止液 450nm波长下读取吸光度 使用专用软件计算结果,操作步骤： 密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs） 洗
4、涤PBMCs 将PBMCs与特异抗原一同加入到预包被抗-干扰素抗体的培养孔 37C孵育16-20小时 洗涤培养孔 加标记二抗 孵育1小时 洗涤培养孔 加显色液 用蒸馏水终止反应 用肉眼判断结果,QuantiFERON-TB,T-SPOT.TB,采血量： 2岁儿童：2-3ml 免疫力低下患者：6-8ml 其他患者：4-6ml,采血量：0.8-1.2ml,两者均有大量手工操作步骤，操作要求高 QFT低采血量，更具优势,IGRA,IGRA适用于高收入、结核低负担国家的潜伏结核筛查 在中低收入国家，尤其是结核高负担国家，不推荐使用IGRA,将IGRA写入国家诊疗指南的有： 美国、加拿大 、英国、法国、
5、西班牙、德国、意大利、瑞士、荷兰、丹麦、挪威、芬兰、爱尔兰、葡萄牙、捷克共和国、斯洛伐克、波兰、保加利 亚、克罗地亚、澳大利亚、沙特阿拉伯、韩国、日本WHO的推荐,欧美发达国家 或/和 结核低负担国家,2011年，IGRA在中低收入国家的政策声明,环介导等温扩增,设备要求较低 操作复杂，人工判读结果,环介导等温扩增,中国CDC推荐可用于基层实验室 无耐药检测 WHO推荐 对于持续有肺结核症状的成人可替代涂片（条件性推荐） 可作为持续有肺结核症状的成人的，可作为涂片的后续检测（条件性推荐） 备注 适用于可开展传统涂片的实验室 不应当替代可检测结核和利福平耐药的快速分子诊断技术，尤其是耐药结核高危
6、人群 由于缺乏证据，TB-Lamp对于持续有肺结核症状的HIV患者的诊断价值，是否优于涂片尚不清楚 TB-Lamp 的推荐只适用于检测持续有肺结核症状的患者的痰液样本 TB-Lamp对儿童患者的检测由于缺乏数据，仅是推测,恒温扩增 试纸条法,操作步骤： 将痰液液化、离心、灭活，制备成核酸扩增模板液 取0.4ul移入1.5ml PCR管中，放入恒温装置中扩增 使用水浴锅或金属浴；63扩增1小时； 将完成扩增的PCR管放入一次性防污染扩增物试纸条检测装置中检测, 15分钟目测定性结果,无需昂贵的仪器 无耐药检测 手工操作相对较少 WHO未评估或推荐,恒温扩增 试纸条法,WHO在2015工作报告新技
7、术章节中提到该技术 但说明目前该技术没有WHO评估并进行推荐所必须的多中心评估的数据,实时荧光RNA恒温扩增检测技术,RNA检测技术，高灵敏度，可区分活菌和死菌，适用于疗效监测 需配备超声波仪，且仍需要实时荧光PCR仪检测 无耐药检测 WHO未评估或推荐 手工操作步骤相对较少,线性探针,结果需要人工判读，或配备专门的设备,WHO 2008年推荐用于涂阳标本检测MDR，2013年更新推荐检测二线药物 全程检测需6-8小时 配套设备繁多，需3个房间，需PCR仪、杂交仪等 手工操作步骤繁多，复杂的结果判读,基因芯片,基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰液样本中结核杆菌的两
8、种一线抗结核药耐药 利福平、异烟肼 WHO未评估或推荐 鉴定与药敏需用两套试剂盒，鉴定药敏各需6小时 配套设备：需不同PCR室，需PCR仪、杂交仪、扫描仪等，需配备扫描仪及配套软件判读,熔解曲线,原理：一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tm值也一定，发生错配时，Tm值下降，下降幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关 2-3小时获得结果，目前通过CFDA的有利福平和异烟肼耐药两套试剂盒 WHO未评估或推荐 配套设备：核酸提取仪、PCR仪等,分子信标,靶序列,杂交体,每个探针用不同的荧光染料标记，允许同时检测。,PCR的目标是rpoB基因的81 bp区域： 5个探针结合到野生型，而不是
9、突变体目标,SPC,半巢式实时荧光PCR（Xpert） WHO与FIND支持研发成果,Its a development that the world has been waiting for, for literally decades. Its something that has the potential of truly revolutionizing the way we deal with TB today.,WHO Endorsement of Xpert MTB/RIF The Test that is Changing the World,Dr. Mario Ravigli
10、one. Director, Stop TB, WHO,2011年WHO评估完成后正式推荐,WHO全力推荐Xpert,各类分子诊断技术比对 （液体培养/DST为金标准）,陈琛等. 分子线性探针测定法杖结核病诊断中的研究进展. 中国防痨杂志. 2016(38): 218. Xichao Ou et al. A feasibility study of the Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Disease. 2015 (31):
11、41. WHO. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children Policy Update. Guo, Y et al. Rapid, accurate determination of multidrug resistance in M. tuberculosis isolates and sputum using a biochip system. International Journal of Infectious Disease. 2009
12、 (13): 914. Xichao Ou et al. A multicenter study of Cross-Priming Amplification for tuberculosis diagnosis at peripheral level in China. Tuberculosis. 2014 (94): 428. 黄芳等. 三种分子生物学诊断技术对结核诊断价值的比较. 中华结核和呼吸杂志. 2015 (38): 680. WHO. The use of a commercial loop-mediated Isothermal amplification assay (TB-
13、Lamp) for the detection of tuberculosis. May 2013. 王冰冰. 荧光PCR熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药检测中的临床应用. 国际检验医学杂志. 2015(35): 608.,文献：3种分子诊断方法比对,无论涂阳培阳还是涂阴培阴，Xpert的检出率均最高,样本：根据“结核病诊断和治疗指南”，收集2014年4-7月西安市结核病胸部肿瘤医院收治的经病理确诊或细菌性确诊的肺结核患者痰标本共378份。,利福平耐药检测对MDR-TB诊疗足够吗？,INH单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案，与此相反，对RIF单耐药的患者，无论INH是否耐药，都会采取与耐多药
14、患者相同的治疗方案1。 约90%利福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者2。Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831.Xichao Ou et al. A feasibility study of Xpert MTB/RIF test at the
15、 peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Diseases. 2015 (31):41-46.,“结核+利福平耐药”对多耐结核控制产生的效果最为显著。即便补充异烟肼耐药，能提升的效果有限,WHO推荐Xpert用于肺外结核的初始诊断,共纳入15项已发表研究和7项未发表研究，涵盖5922例样本，大多数研究（59%）来自结核高负担地区。,WHO推荐Xpert用于结核的初始诊断,WHO 数据: 灵敏度66%, 特异性 98%,南非经验: 2011年6月-2012年5月，484 例患者, 年龄中位
16、数24个月，痰液都是非诱导痰 63% 的样本体积132月）的儿童阳性率更高 Xpert MTB/RIF: 灵敏度 62.5% (25, 91), 特异性 99.1% (98, 99.9) 涂片: 灵敏度 33% (8, 7)，特异性99.5% (98, 99.9),Xpert 检测儿童痰液，明显优于涂片；检测粪便标本性能同样优异,痰 液,粪 便,易于使用的样本处理器 (0.6g, 1.2g, 拭子) 粪便（0.6 g）的性能和呼吸道标本效果相当，且非侵入式样本更适合儿童,快速、即时的分子诊断实现检测就治疗,韩国，国立首尔大学医学院 2011年1月-2013年5月 681例患者 Xpert MT
17、B/RIF可将从接诊到开始抗结核治疗的平均时间从21天缩短为6天,南非全国使用Xpert逐步替代涂片，耐药结核负担明显下降,2016 CATA, 南非NHLS优先项目负责人Wendy Stevens教授分享南非经验,南非在矿区及矿区周边社区使用Xpert对重点人群进行筛查,南非用Xpert检测肺外结核经验 (约翰内斯堡研究，n=1175),Xpert 检出率是260/1175，与液体培养 相当277/1175 Xpert 灵敏度59% (CI 53, 65) ，特异性92% (CI 90, 94). 脓、抽吸物的的灵敏度最高，然后是(腹水，然后是胸水). 浓稠样本的灵敏度最高87% (CI 7
18、6, 94)，清液样本灵敏度较低 48% (CI 36, 61). 痕量血液不影响检测性能 52% (CI 44, 60) ，离心也不影响检测性能57% (CI 28, 82) Xpert 相比液体培养（10.5%污染），不容易受污染影响，同时可更早获得利福平耐药结果. Xpert检测脓和抽吸物的特异性低于呼吸道样本，但这些都是真阳性,未来：Xpert Ultra 替代培养,Xpert MTB/RIF 痰液的检测下限为50-165 CFU/ml，2小时出结果 检测靶标：rpoB基因，5个探针检测突变，25 ul DNA用于PCR反应 涂阴标本的灵敏度60-80% 替代涂片的策略,Xpert U
19、ltra 痰液检测下限为 5-25 CFU/ml 新的样本处理试剂盒（50ul DNA用于PCR反应） 检测靶标：IS16110、IS1081和ropB基因片段4个探针检测突变 优化的试剂盒流体技术和PCR循环（熔解曲线） 70分钟出结果 替代培养的策略,野生型,FIND基金和约翰内斯堡的医疗机构合作，10个国家进行多中心评估,WHO 2015 结核诊断策略执行框架,分子诊断 Xpert MTB/RIF：WHO推荐可检测成人和儿童的痰液、痰沉淀、部分肺外结核标本；检测利福平耐药的灵敏度为95% 线性探针：WHO推荐其可用于检测利福平耐药相关基因突变，以及氟喹诺酮耐药检测；检测异烟肼耐药的灵敏度
20、低于培养（约85%）潜伏性结核诊断 无金标准 WHO推荐中-高收入国家可采用IGRA，不建议低收入国家用IGRA替代皮肤菌素试验 WHO不建议血清学检测进行肺结核、肺外结核诊断 IGRA不应用于活动性结核诊断,WHO 2015 结核诊断策略执行框架,患者发现、治疗、随访及监测，开发并提供参考方法和标准，管理各级实验室,患者发现、治疗、随访,筛查，患者发现、转诊和治疗,涂片镜检、 Xpert MTB/RIF,涂片镜检、Xpert MTB/RIF、 条件允许时用固体培养和线性探针检测涂阳痰液,涂片镜检、Xpert MTB/RIF、 固体培养和线性探针检测涂阳和培养阳性痰液、液体培养、DST检测一线和二线抗结核药物,实验室功能,实验室分级,适用检测,美国将Xpert MTB/RIF阴性结果用作解除隔离决策的依据,美国国家结核控制协会（NTCA） 美国公共卫生检验协会（APHL）Xpert 阴性=排除结核,谢 谢 大 家！,
