1、T-SPOT.TB诊断结核感染 临床应用进展,主要内容,结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用,2,主要内容,结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用,3,结核的现状,结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO统计，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年有约200万人死于结核。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2倍以上。,4,中国是结核感染高负担国家,患者人数占全球的14.3%，具体表现为“五多” 感染人数多5.5亿人感染过结核 患病人数多现有活动性肺
2、结核患者500万 潜伏感染人数多受限于检测条件较难统计，2009年流行病调查结果为总人口的44.5%（因采用PPD检测，假阳性较多） 新发患者多仅活动性肺结核2009年新发病患107万 死亡人数多13万/年,5,结核的传统诊断手段,结核菌素皮试： 低敏感性：免疫力低下人群中其敏感性大大降低。 低特异性：与卡介苗接种和其他环境分枝杆菌有交叉，易造成“假阳性”结果。 免疫学诊断 抗原、抗体（胶体金） 细菌学检查：常规培养：2月；快速培养：1周；涂片阳性率取决于采集标本中细菌数量，不利于早期诊断。 病理学检查：阳性率低，对取材有较高要求，有创伤，对肉芽肿性病变需进一步鉴别。 分子生物学诊断 PCR
3、影像学检查,6,免疫学诊断,PPD皮肤试验,抗体检测,假阳性率高 48-72h读取结果,敏感性、特异性差,7,WHO关于血清学检测声明,2011年7月20日，世界卫生组织（WHO）正式声明，要求禁止将血清学检测方法（抗原，抗体，蛋白芯片等）用于肺结核和肺外结核的诊断。,WHO warns against the use of inaccurate commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB.A substandard test with unreliable resultsTB can be wrongly
4、 diagnosedA serological test for diagnosing active TB disease is bad practiceProblems of misdiagnosisThe inaccurate serological tests are costlySelling substandard tests with unreliable results,8,细菌学诊断,阳性率低 含菌量1万/mL痰液,需时4-6周,9,快速培养系统,1. BD BACTEC MGIT 960培养系统 2. BacT ALERT 3D培养系统,10,分子生物学诊断,实时荧光定量PC
5、R技术：HRM 线性探针耐多药检测技术：HAIN技术 基因芯片 PCR 电离质谱检测技术,11,病理学检查,阳性率低 对取材有较高要求，有创伤 对肉芽肿性病变需进一步鉴别,12,影像学检查,目前诊断活动性肺结核的重要手段，尤其是粟粒性肺结核 对潜伏性结核诊断价值不大 对肺外结核诊断价值不大,13,现有检测手段不能满足临床要求,假阴性：免疫力低下或HIV人群，新生儿、老弱人群，药物影响； 假阳性：BCG接种人群，其它分支杆菌感染，交叉污染 肺外的结核感染无法明确诊断 抗痨治疗疗效无法评价 无法排筛结核感染，造成生物制剂或移植手术治疗后病患免疫力下降，引发结核，形成医疗事故,14,主要内容,结核病
6、及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用,15,21世纪结核检测的重大突破,-干扰素释放实验（IGRAs)被商化（2006年），用于结核感染的检测 将结核菌特异性抗原加入含受试者的血液标本的培养基中进行孵化，如果受试者受到过MTB感染，那么被结核菌激活的记忆T细胞就会对这些特异性抗原产生反应，发生增殖分化并释放-干扰素 通过定量检测-干扰素的释放水平，来诊断MTB感染 T-SPOT.TB(结核感染T细胞斑点试验),16,17,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，结核感染后体内长期存在抗原特异性的记忆性T细胞 当再次遇到抗原
7、刺激时，能迅速活化增殖，释放r干扰素 r干扰素是结核分枝杆菌感染后机体免疫应答中最重要的细胞因子,18,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,T-SPOT.TB技术： 利用结核杆菌感染者外周血单核细胞（PBMC）中存在结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异抗原刺激后分泌r干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放r干扰素的T淋巴细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表一个细胞，计算出抗原特异性细胞的频率。,19,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,包,20,基于T淋巴细胞检测结核感染的原理,患者体内存在针对MTB的效应T淋巴细胞
8、,患者体内不含针对MTB的效应T淋巴细胞,21,T-SPOT.TB的临床意义,T-SPOT.TB高灵敏度,22,T-SPOT.TB的临床意义,23,T-SPOT.TB的临床意义,T-SPOT.TB高特异性ESAT-6CFP 10均来自结核分枝杆菌基因组RD1区域仅结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）存在 RD1区基因卡介苗和大多数环境分枝杆菌缺失RD1区基因（M.gordonae、M.kansasii、M.marinum、M.szulgai）T-SPOT.TB不会受卡介苗接种及其他分枝杆菌的影响,24,T-SPOT.TB的临床意义,25,T-SPOT.TB 的高特异性与灵敏度，给临床准确、
9、快速的诊断结果,特异性 美国FDA临床研究数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床研究数据：特异性94.1%(478/508) 灵敏度 美国FDA临床研究数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床研究数据：灵敏度95.3%(624/655),26,T-SPOT.TB的临床意义,基于结核抗原特异性T细胞向病变部位集中的特点， T-SPOT.TB的检测物已不局限于静脉血，支气管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等也可用于对肺内及肺外结核的诊断。 敏感性优于ADA、TB-DNA，约在62-75%，特异性无统计学差异。,27,T-SPOT.TB的临床意义,在结核病治疗中的评价意义 效应
10、T细胞随结核杆菌的清除而消失，其阴性及阳性结果可作为评估治疗效果的手段之一 。,28,T-SPOT.TB的缺点,仍有一定的假阳性及假阴性结果 实验结果是对结核感染的判断，阳性结果包括了活动性结核及潜伏性结核感染的可能，需要结合临床来确诊是否是结核病患者 不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床来判断,29,主要内容,结核病及其诊断现状 T-SPOT.TB的原理及其特点 T-SPOT.TB技术的应用,30,病例1,患者，男，35岁 患者于一月前开始无诱因下出现高热、胸闷，动则气急，无咳嗽，咯血，盗汗 。 胸片：两肺（），右侧胸腔积液，心包积液 心超：心包积液 心包穿刺：血性 诊断：肿瘤？结核？
11、细菌感染？,31,检测结果,外周血T-SPOT.TB：阳性 心包积液T-SPOT.TB：阳性 诊断：结核性心包炎 治疗： INH、RFP、PZA、EMB、强的松 体会：诊断快速 心包积液结核培养6周后报阳,32,病例2,患者，女性，60岁，浙江温州人 主诉：反复发热2月余，头痛2周伴意识障碍2天 外院头颅MRI见脑实质内弥漫性点状、结节状及环形病灶。 有皮肌炎史，外院予激素治疗,33,腰穿,压力250mmH2O，有核细胞420x106/L，糖0.6mmol/L，蛋白1688mg/L，氯化物136mmol/L 隐球菌乳胶凝集试验：阴性,34,治疗：抗细菌+抗结核,美罗培南、利奈唑胺、异烟肼、利福
12、平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇治疗，同时予甘露醇250ml q8h及地塞米松每天7.5mg。 2天后患者体温即平，意识障碍好转 脑脊液T-SPOT.TB：阳性 诊断：倾向结核性脑膜脑炎,35,五联抗结核,给予HRZE及左氧五联抗结核 2周后，CSF分枝杆菌快速培养：阳性 3个月后：,36,病例3,女性，14岁，初中学生 主诉：发热1月余 患者5月初无明显诱因下出现发热，Tmax：39，以午后为著。伴头晕、畏寒、盗汗，不伴寒战、咳嗽、咳痰、四肢肌肉痛、皮疹等，家人自行予退烧药（具体药物不详），体温可恢复正常，但午后体温仍反复 2013-05-24患者就诊，查血常规示：WBC: 4.7x109/L， N:
13、43.2% 。查尿常规示：WBC:8-10个/HP，Pro(+)。考虑为尿路感染，予头孢丙烯等抗感染治疗，但仍出现反复发热，病程中，患者无尿频、尿急、尿痛、腹胀、腹痛、腰痛等不适 2013-06-01予希刻劳0.5g及罗氏芬2.5g对症治疗后体温有所好转，但停药后体温仍上升 2013-06-09查肺CT示：左肺上叶炎性病变。增强CT示：左肺上叶炎性病变，左肺门及纵膈淋巴结肿大。B超示：左侧锁骨上、双侧腋窝（右腋下明显）淋巴结肿大,37,结核病的实验室诊断停留在上世纪50年代水平,38,入院后实验室检查,血常规：WBC:3.83x109/L, N:50.4%, L:39.4%, M:9.9%,
14、Hb:118g/L, PLT:231x109/L ESR：71mm/h。CRP：正常 尿常规（-） 自身抗体（-） 肿瘤标记物（-） T-SPOT.TB（+）,39,上腹部 增强CT,40,肺CT,2013-06-24肺CT(增强)：左肺上叶炎症，结核可能；纵隔内多发肿大淋巴结可能，淋巴结结核可能,41,淋巴结穿刺,右腋下淋巴结穿刺涂片 见大量淋巴细胞、少量凝固性坏死物、 上皮样细胞，结核性淋巴结炎可能,42,诊断,亚急性血源播散性结核病：肺结核、淋巴结结核、脾结核 抗结核治疗：HREZHEZS,43,潜伏性结核感染的筛查,接触活动性结核病患者,暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除,没有症状
15、,结核杆菌仍旧存在而不能被侦测 X-光/ CT 扫描显示正常没有抗体应答诊断困难传统的结核感染检测只有 TST（PPD）,机体被感染,受机体免疫力抑制 没有临床症状,终身处于感染状态,潜伏感染,有临床症状 具有传染性,结核杆菌可以通过涂片、培养检测出胸部的 X-光或 CT 扫描显示异常肺外结核难以诊断 (特别是儿童),活动性结核,5%,5%,再次激活,44,活动性结核与潜伏性结核,45,我国普通人群中LTBI流行率评估,46,小结,结核病在临床上仍不容忽视，但诊断仍存在难题 T-SPOT.TB（尤其是体液检测）大大提高了结核的诊断效率，缩短了结核诊断时间 T-SPOT.TB对我国潜伏性结核的筛查，结果更加可靠,47,谢谢,48,
