1、血细胞分析仪检测技术及临床应用,血细胞分析仪检测是临床诊断工作中最常用的实验方法之一40年代后期美国库尔特先生(W.H.Coulter)发明了粒子计数技术(电阻抗法),50年代初期应用于血细胞计数,血细胞分析仪检测原理,一.电阻抗法(库尔特原理) 1.血细胞具有非传导性质(不良导体) 2.E=I x R脉冲信号 3.脉冲信号大小与细胞体积成正比 4.脉冲信号的多少代表细胞数量,细胞的三分群： 各种细胞在溶血剂中，经溶血剂中表面活性剂对细胞膜表面的脂蛋白作用后而分群，由于RBC膜表面的脂蛋白含量最少而易被破坏溶解,白细胞的细胞浆漏出，仅留下核与颗粒并使细胞缩小，原来最大的单核细胞经溶血剂作用后，
2、体积就落在了小的淋巴和大的中性粒细胞之间，这样就按照溶血剂作用后体积大小，将白细胞分成三群。,淋巴细胞：35-90fl; 中间细胞：90-160fl; 粒细胞160fl 依照三群细胞在白细胞体积分布的直方图上所分布区域的面积，计算得出每群细胞的百分比，并依照白细胞计数总数，求得每群细胞的绝对值。 注意:各厂家的溶血剂配方不完全相同,对白细胞膜的作用程度不同,而各厂家对仪器的各类WBC区分设置也不尽相同.,RBC及相关参数的检测 RBC检测电阻抗原理 脉冲信号高度的叠加HCT 单个脉冲信号高度的均值MCV RBC:36360fL区间分析 RDW:仪器将不同大小的脉冲信号分别贮存在不同通道,计算出
3、相应的体积和数目,再统计处理得到RDW,用RBC体积的CV或SD表示. RBC计数中WBC含量可忽略不计,但在白血病或WBC异常增高时则对RBC及其相关参数有明显影响.,PLT检测:电阻抗原理 PLT和RBC一起同时被检测 PLT体积分布:228fL,不同仪器的PLT直方图 范围不一. MPV:是PLT体积分布直方图的产物 MPV与PLT成非线性负相关 PCT参考范围是一不恒定参数 PDW:是PLT体积分布直方图的产物 PLCR:12fL的PLT比率,浮动界标技术 1.RBC/PLT : 为便于识别，在RBC/PLT通道一般把体积大于30f1的细胞计为红细胞(RBC)，而把体积小于30f1的细
4、胞计为血小板(PLT)。一般的血细胞分析仪，PLT和RBC的分界点是固定的(例如30f1处)，这种情况属于固定界标。但也有例外的情况，有些公司的血细胞分析仪，可以把PLT和RBC的分界点人为地设置在5-30f1的范围内，在实测样本时，仪器根据PLT和RBC的分布曲线，自动在所设定的范围内寻找最低点，以得到正确的PLT. RBC及相关参数的结果，这就是浮动界标.,2.WBC : 当直方图出来后，由软件程序自动判别并寻找直方图上三个区域的起止点（即第一个高峰起止和第二个高峰地点）作为界标线，并以此为依据进行判读，由于设计理念的不同，稀释液和溶血剂对细胞的作用不同于固定界标，因此，浮动界标的wbc直
5、方图很少有能超过350fl的横坐标。直方图每次的结果是不一样的，因此界标线的位置也是不一样，这就形成界标线的移动，就是浮动界标,Hb检测:与WBC一起被检测SLS-HGB检测血红蛋白： 测定原理：亚铁血红素中的Fe2+离子被十二烷基磺酸钠氧化，形成SLS-HGB衍生物，在550nm波长进行比色测定。 SLS-Hb法测定与ICSH的参考方法相比，具有非常高的相关性(r=0.999)。,二.血细胞检测技术的发展（五分类） 1。光散射法(Scatter):来自激光光源的单色光束在10-70对细胞进行扫描,提供细胞结构、形态的光散射信息。光散射特别具有对细胞颗粒的构型和颗粒质量的区别能力，从而将三种粒
6、细胞区分。利用高低角度光散射可同时对PLT和RBC进行计数.高角(5-15)测量RBC数,检测PLT内容物.低角(1-3)检测RBCPLT体积.,2。电导法根据细胞壁能产生高频电流的性质采用高频电磁探针，测量细胞内部结构、核浆比、细胞内颗粒大小和密度。电导法可辨别体积相同而性质不同的两个细胞群（如；小淋巴和嗜碱）,3。射频技术；在测量小孔的内外电极装有直流和高频两个发射器，因此在小孔周围产生直流和射频两种电流，直流电仅能测量细胞大小，而射频可透入细胞内，测量核的大小及颗粒的多少。利用阻抗+射频技术可将淋巴、单核、粒细胞区分。,4.过氧化物酶染色技术过氧化氢酶含量:嗜酸粒细胞中性粒细胞单核细胞.
7、 淋巴和嗜碱粒细胞无由于酶反应阳性程度不同,通过激光束时的吸光度也就不同,加上光散射及特殊溶血剂的作用可进行五分类.,5.核酸荧光染色技术 利用聚次甲基荧光染色液对有核细胞的核酸(DNA/RNA)进行荧光染色。采用半导体激光流式细胞检测，获得WBC/DIFF散点图并得到新的检测参数IG和OTHER。通过对散点图的分析，可获得LYMPH、MONO、EOS、NEUT+BASO及NRBC和Ret的测定结果。最早的全自动网织红分析仪R-1000TM，用荧光染料碱性槐黄；最新采用的是聚次甲基染料，用来进行WBC四分类、网织红细胞测定、有核红细胞测定，该染料被红色半导体激光（波长为633nm）激发后发出6
8、60nm或更高波长的红色荧光。,该技术采用检测三种光学信号(前向散射光、侧向散射光、侧向荧光)进行白细胞分类的测定。 前向散射光：细胞大小信息。所采集的前向散射光信号用于对WBC/BASO的测定。 侧向散射光：反映细胞核及颗粒的信息(主要是颗粒的复杂性) 。所采集的侧向散射光信号用于WBC/BASO和WBC/DIFF的测定。 侧向荧光：通过对核酸(DNA和RNA)进行染色，荧光信号提示细胞核酸的信息。所采集的侧向荧光信号用于WBC/DIFF 的测定。,三.血细胞分析检测项目的进展 1.幼稚细胞的检测: 幼稚白细胞膜上的脂质较成熟白细胞为少，使用含有能固化细胞膜和胞浆的硫化氨基酸的溶血剂，由于脂
9、质的成分、含量及在细胞膜上的占位不同，结合在幼稚白细胞上的硫化氨基酸较成熟白细胞为多，使胞膜和浆都固化，对溶血剂中具有溶血作用的非离子表面活性剂具有抵抗作用，加入溶血剂后，成熟白细胞被溶解，而幼稚白细胞得以保存 ,通过DC检测出幼稚细胞,核酸荧光染色:根据细胞成熟度的不同可以体现在其荧光信号的强弱上，其白细胞分类通道除正常细胞分类外，还有两个幼稚白细胞的定量参数： IG （幼稚粒细胞）和 Other （原始细胞 / 异常淋巴） ,激光照射后产生荧光信号，和侧向散射光一道绘制成二维散点图进行白细胞分类。,利用幼稚细胞(IMI)的检测可应用于外周血干细胞移植(PBSCT). PBSCT技术的关键是
10、确定移植所需PBSC的量和采集PBSC的最佳时机. 在外周血幼稚或原始细胞增加的同时,伴随着干细胞的增加,因此IMI+细胞可间接反映PBSC 骨髓多能干细胞无法检测,而粒巨噬细胞集落形成单位系造血干细胞分化而来是造血祖细胞(HPC)的一种 基于骨髓和外周HPC表达同样的CD34+因此可用流式分析HPC, 含CD34+细胞不是单一细胞而是包括原始到不成熟粒细胞的连续分布群。因此在血细胞分析仪上利用幼稚细胞的检测可间接反映HPC,2.有核红细胞的测定 将血液和测定有核红细胞的试剂相混合，正常红细胞中的血红蛋白渗出，只剩下光学透明的细胞膜或碎片。有核红细胞和白细胞被试剂中的聚次甲基染料快速渗入。但有
11、核红细胞的核很难和染料结合，因为它的核染色质发生固缩，不易着色。 着色后的细胞排成流式细胞，并被633nm的红色激光束照射，测得细胞所产生的前向散射光强度和侧荧光强度。二维散射图的横坐标表示侧荧光强度、纵坐标表示前向散射光强度。,以前检测有核红细胞的分析系统中，用酸性低渗性盐溶液作为溶血素，用PI（propidium iodide）或EB溴化乙啶 （ethidium bromide）染有核红细胞的核，但是该方法不能从损伤（死亡）的淋巴细胞中区分有核红细胞,3.网织红细胞检测(血细胞分析仪器)1.用新亚甲蓝(A 液) 染红细胞内RNA;再用含透明剂的硫酸(B 液) 使红细胞内血红蛋白溢出,成为影
12、细胞,处理后的血液在仪器上应用VCS原理进行检测(Coulter) 2.将抗凝全血加入网织红细胞试剂(氧氮杂芑750)中，孵育1545 min上机测定，数据分析由仪器中网织红细胞分析程序完成，无需人工干预。(Technicon H*3) 此两种方法均为人工机外染色,3. Sysmex 早期采用碱性槐黄作染料,用于网织红计数仪(R系列). 后采用激光流式原理和细胞核酸染色。除了进行自动的 RET 数目和百分比计数外，还可以通过核酸染色得到的荧光信号强度区分低、中、高荧光强度的网织红（ LFR 、 MFR 、 HFR ）。由于幼稚的网织红荧光信号较强， MFR 和 HFR 之和即反映未成熟网织红的
13、一个有用参数RMI .(XE-2100 、 XT-2000i )。,4.运用免疫表型法配合VCS检测技术分析CD4、CD8白细胞亚群 先以抗CD4及CD8的抗体包被乳胶球标记CD4、CD8阳性细胞，被标记的细胞在激光散射的特性方面与其它细胞明显不同，上机后可被仪器识别并计数。 可在5分钟内快速得到CD4、CD8细胞的绝对值、百分比、和CD4CD8比值,5.网织血小板检测网织血小板（Reticulated Platelets, RP）是从骨髓释 放入血的新生血小板，与成熟血小板相比 ，体积大，蛋 白质合成能力强，RNA含量多。 1 网织血小板的得名:1969年国外学者应用新亚甲蓝染 料,对犬外周
14、血进行染色，发现血小板内有一种网状结构 物，故将这一部分血小板命名为网织血小板 2 网织血小板检测方法 :荧光色素-噻唑橙（thiazole orange,TO）。奥黄O（Auramine O,AO）,四.保证计数精密度准确性的技术 1容量限定:稀释液容量控制浮球定量 2控制细胞通过小孔时及计数准确性的技术重叠校正脉冲编辑高精度体积分析扫流技术鞘流技术浮动界标技术延时 计数 电子拟合曲线,在目前国内众多的五分类血液分析仪当中，主要品牌有：光电、ABX、东亚，库尔特、雅培、拜尔,COULTER MAXM五分类血细分析仪 集库尔特原理及VCS技术于一身，提供完整的白细胞五项分类和全血细胞计数 运用
15、流体动力（鞘流）令细胞成单一排列，逐个通过检测位置，每个细胞同时接受VCS三项技术的测量，VCS测量技术包括细胞体积(V),细胞传导性 (C)及细胞激光散射性（S）。 以活性染料新亚甲蓝（NMB）对网织红细胞进行染色，漂清本底后，运用激光散射技术从成熟的红、白细胞和血小板中辨别出网织红细胞并计数。,XE-2100 XE-2100采用了先进的半导体流式细胞分析系统结合核酸荧光染色技术，是目前世界上速度最快的血液分析仪器（150个标本/小时）；同时还可以为临床提供更多的定量的检测参数，包括有核红细胞（NRBC）、造血祖细胞（HPC）、未成熟粒细胞（IG）、网织红细胞（RET）等36个参数；XE-2100具有7种检测模式，可以随机任选进样；同时还具有强大的联网功能及可拓展为血液分析流水线。 。 XE-2100使用电阻抗光学两种方式，提供可靠的血小板计数。 新参数：NRBC，IRF（不成熟网织红细胞分布），HPC*(造血原始细胞)，IG*（不成熟粒细胞）。,
