1、Comment U1: 标题需更准确的反映全文主要研究工作与结果。基金项目：陕西省教育厅专项科研计划项目12JK0768作者单位：710032，第四军医大学西京医院检验科（李卓，李蕊，郝晓柯，马越云） ；710077，西安医学院第一附属医院检验科（李卓，康炜）通讯作者：马越云，电子信箱：1人血清 Exosome的分离及其 miRNA标志物分析方法的建立李卓，康炜，李蕊，郝晓柯，马越云【摘要】 目的 分离、鉴定人血清中的 Exosome，检测其中 miRNA含量和质量，探讨将人血清中 Exosomal miRNA作为疾病分子标志物的可行性。方法 采用 ExoQuick从人血清中分离 Exosom
2、e，分别用透射电镜、 NanoSight纳米颗粒分析仪和 Western Blot 对其进行形态学和分子表型鉴定，使用 Agilent 2100生物分析仪进行 Exosomal RNA质量分析。通过 qRT-PCR检测 Exosomal miRNA，并对血清不同组分的 miRNA表达量进行比较分析。 结果 从人血清中可以分离获得圆形或椭圆形囊泡样物，直径主要集中在 40-100 nm，最大分布峰值为 58 nm，表达热休克蛋白 Hsp70和四跨膜蛋白 CD63，确系Exosomes；Agilent 2100生物分析仪结果显示，该 Exosome中的 RNA组分主要为约 25nt的小 RNA，提
3、示可能为 miRNA；qRT-PCR 检测证实 4种常见miRNA在人血清 Exosome中均有表达；进一步对血清的不同组分进行比较，发现 Exosome中 miRNA的表达量高于全血清样本和去除 Exosome的上清（P0.05） 。结论 人血清中可以有效分离到 Exosome，其中存在较高浓度的miRNA。分离血清 Exosome有利于循环 miRNA类的疾病标志物的检出。【关键词】 Exosome；血清；miRNAComment U2: 标题改用名词短语来表述Development ( or Establishment ) of a protocol for serum exosome
4、isolation and miRNA quantitation Comment U3: 是含有还是表达？Comment U4: Four 指 type four 还是指什么？2Establish a method for separation and analysis of miRNA markers for serum exosomeLi Zhuo*, Kang Wei, Li Rui, Hao Xiaoke, Ma Yueyun*Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital Affiliated to Fourth Military
5、 Medical University, Xian 710032, China. * Department of Clinical Laboratory, First Affiliated Hospital of Xian Medical University, Xian 710077, China Corresponding author: Ma Yueyun, Email: 【Abstract】 Objective To isolate and identify exosomes from human serum, analyze the expression characteristic
6、s of exosomal miRNA, and explore the feasibility of detecting exosomal miRNA in human serum. Methods Exosomes were isolated from human serum using ExoQuick, and then identified by using transmission electron microscopy, NanoSight nano particle analyzer and Western Blot for morphology and molecular p
7、henotype. The quality of exosomal RNA was analyzed using Agilent 2100 Bioanalyser. Then qRT-PCR was carried out to detect exosomal miRNAs in different components of human serum. Results Exosomes isolated from human serum showed round or oval vesicles, mainly in diameter 40-100 nm, and with maximum p
8、eak at distribution of 58 nm. Moreover, they expressed Hsp70 and four transmembrane protein CD63. Agilent 2100 Bioanalyzer results showed that the major RNA component of exosome was about 25nt small RNA, suggesting that it may be miRNA. qRT-PCR analysis confirmed that 4 miRNAs were expressed in huma
9、n serum exosome. It was further found that the expression of miRNAs in exosome pellets were higher than the whole serum and exosome-depleted supernatant (P0.05). Conclusion Exosomes, which express miRNAs, can be isolated from human serum. Separation of serum exosome may be helpful to improve the det
10、ection of these circulating miRNAs.【Key words】 Exosome; Serum; miRNA外周血因其具有创伤小、易获取、可重复、可检测指标众多等优点，一直3是临床疾病标志物检测的主要标本来源。近年研究发现，外周血中存在内源性循环 miRNA，且因其具有较高的稳定性和特异性，有望成为诸如肿瘤等多种疾病的生物学标志物 1。然而，循环 miRNA 的检测效率却由于含量低等原因不能满足临床检测要求。Exosome2是细胞释放到胞外环境中的膜性小囊泡，直径约为 40-100nm。有研究者提出假说，循环 miRNA 主要存在于 Exosome 中 3, 4。有
11、可能成为良好的检测血清 miRNA 的来源。为此，本研究从人血清中分离并鉴定 Exosome，采用 qRT-PCR 验证 Exosomal miRNA 的存在，进而对血清不同组分中 miRNA的含量进行比较分析，以探讨外周血中循环 miRNA 与 Exosome 的关系，从而为进一步寻求新的疾病生物学标志物奠定研究基础。材料与方法一、材料1主要仪器与试剂：Tecai G2 Spirit 透射电子显微镜（美国 FEI 公司） ，NanoSight LM10-HS 纳米颗粒分析仪（英国 Malvern 公司） ，Qubit 2.0 荧光计（美国 Life Technologies 公司） ，Agi
12、lent 2100 生物芯片分析系统（美国 Agilent Technologies 公司） ，7500 Fast Real-Time PCR 仪（美国 Applied Biosystems 公司）；ExoQuick Exosome 沉淀试剂、SeraMir Exosome RNA 提取试剂盒 (美国System Biosciences 公司 )，兔抗人 HSP70 抗体、兔抗人 CD63 抗体（美国 Ray Biotech 公司） ，Real-Time PCR 试剂盒（大连 TAKARA 公司） ，Bulge-Loop TM miRNA qRT-PCR 引物（广州锐博公司） 。2血清来源：1
13、0 名西京医院门诊体检健康男性，年龄 4065 岁，空腹采集静脉血 5mL，室温静置 30min，3000g 离心 15min，留取血清。二、方法1血清 Exosome 提取：将血清 1.5mL 3000g 离心 15min，去除残留细胞及细胞碎片，转移上清至新管，用 0.22m孔径的滤膜进行过滤。采用ExoQuick Exosome 沉淀试剂提取血清 Exosome，具体操作依照说明书进行。取500L过滤后的血清，加入 120L ExoQuick 试剂，充分混匀。4静置30min，1500g 离心 30min，弃上清。再次 1500g 离心 5min，尽弃上清，所得沉淀即为 Exosome。
14、42透射电镜观察 Exosome：将离心所得的 Exosome 沉淀物溶解于 50L PBS 中制成悬液，载样于铜网上，室温静置 2min，用滤纸轻轻从侧面吸干液体，滴加磷钨酸溶液 20L于铜网上，室温负染 2min，滤纸吸干液体。自然干燥后采用透射电子显微镜进行观察。3NanoSight 纳米颗粒分析仪检测 Exosome：将离心所得的 Exosome 沉淀物溶解于 500L PBS 中制成悬液， 1:4000 稀释，充分混匀后取 300L上机，采用 NanoSight LM10-HS 纳米颗粒分析仪进行粒径和浓度分析。4Western Blot 检测：采用 BCA 法进行 Exosome
15、蛋白定量。分别取Exosome 沉淀物和去除 Exosome 的血清蛋白样品各 20g，按标准操作进行Western Blot 检测。12% SDS-PAGE 凝胶电泳，电转膜，室温封闭 1h，分别加入兔抗人 CD63 和 HSP70 抗体（1:1000 稀释） ，4孵育过夜，TBST 洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1:5000 稀释） ，采用 Odyssey 红外荧光扫描成像系统进行结果扫描。5Exosomal RNA 提取和鉴定：按照 SeraMir Exosome RNA 提取试剂盒操作说明，采用吸附柱进行 RNA 富集，每 500L血清来源的 Exosome 最终可得到约
16、30L RNA 溶解液。采用 Qubit RNA 定量仪对其进行浓度测定，并采用Agilent 2100 生物分析仪进行 RNA 质量分析。 6逆转录反应：采用 PrimeScriptTM 逆转录试剂盒和 miRNA 特异性茎凸环结构引物进行逆转录。总反应体系为 10L，包括 2L 逆转录缓冲液、0.5L逆转录酶混合物（含 dNTP、RNA 抑制剂） 、0.5L 特异性逆转录引物（2M） 、500ngRNA，余量用 Rnase-Free dH20 补足。上述体系轻柔混匀、离心，按如下条件进行逆转录反应：42 15min，85 5sec。7实时荧光定量 PCR 检测：成熟 miRNA 的表达水平
17、，采用 SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）试剂进行实时荧光定量 PCR 检测。反应体系为 20L，包括 10L 2SYBR Premix Ex TaqTM，正、反向引物（10M）各 0.4L，ROX Reference Dye 0.4L，cDNA 2L，双蒸水 6.8L。每个miRNA 检测设 3 个平行复孔，使用 ABI 7500 Fast Real-Time PCR 仪，反应条件为：95 30sec 预变性，95 3sec、60 30sec， 40 个循环。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线。引入 cel-miR-39 作为外参，采用 2-CT 计算
18、miRNA 的相Comment U5: cel-miR-39 本身在Exosome 和血清含量有无差别？其差别会否影响 Exosome 和血清中 4种miRNA 相对定量的比较？5对表达量。数据用 GraphPad Prism 5软件进行分析。结 果一、人血清 Exosome的提取：经过 ExoQuick试剂分离，所有血清样本均可提取到 Exosome沉淀物，为淡黄色脂样沉淀。二、人血清 Exosome的鉴定1形态学鉴定：Exosome提取物经透射电子显微镜下观察，呈圆形或椭圆形膜性小囊泡，直径约 40-100nm，包膜完整，内为均一的低电子密度物质。整个观察视野中，未见细胞碎片及其他亚细胞器
19、（图 1） 。NanoSight纳米颗粒分析仪检测结果显示，提取物的直径主要集中在 40-100 nm，最大分布峰值为 58 nm，浓度为 1.46 x 108个/ml （图 2） 。2分子表型鉴定：经 Western Blot分析，血清 Exosome样本中可见明显的 Exosome标志物 HSP70和 CD63的表达条带，而去除 Exosome的血清上清液中二者均未能检测到（图 3 A） 。3Exosomal RNA 质量分析：将提取到的 Exosomal RNA采用 Agilent 2100进行 RNA组分分析，结果显示其中富含约 25nt的小 RNA，而 18S rRNA、28S rR
20、NA未测得。提示人血清来源的 Exosome中主要成分可能为 microRNA（图 3 B） 。三、血清 Exosome中 miRNA的表达情况：为明确血清 Exosome中是否含有 miRNA，我们首先分离血清 Exosome，提取 RNA，选取 4种常见miRNA（分别为 miR-21，miR-16，miR-20a 和 let-7a） 10, 18采用 qRT-PCR进行检测，并将 CT值小于 40定为可检出限。结果表明， 20例样本中均可检出 4种 miRNAs的表达（图 4） 。证实了血清 Exosome中确有 miRNA。四、Exosomal miRNA与血清中游离 miRNA的表达
21、比较：为进一步探究血清中 miRNA的分布情况，我们分别对血清 Exosome与相应去除 Exosome的血清上清以及不做处理的全血清提取 RNA，引入 cel-miR-39作为外参，并进行qRT-PCR检测。结果显示， Exosome沉淀与上清中均可不同程度的检出miRNA，且 Exosome中 4种 miRNA 的相对表达量均显著高于去除 Exosome的上清（6.610.27 至 8.360.28倍） （P0.001）和全血清样本（ 3.830.02至Comment U6: 4型？65.170.43倍） （P0.05） （图 5） ，即血清中 Exosomal miRNA的含量显著高于全
22、血清样本和去除 Exosom血清上清，提示 miRNA在血清中的表达有可能主要来自 Exosome，分离血清 Exosome有利于提高循环 miRNA的检出灵敏度。讨 论Exosome是细胞多泡体（MVB）与质膜融合并把其内含有的小泡释放到胞外基质中而形成的一类膜性小囊泡，直径约为 40-100nm，最初由 Johnstone等 5 从网织红细胞的培养上清液中分离所得。随后，研究发现多种细胞均可形成并分泌 Exosome（如树突状细胞、肥大细胞、T/B 细胞、血小板、上皮细胞、肿瘤细胞等） ，不同来源的 Exosome会携带其来源细胞的蛋白质、脂类和 RNA，因此可以提示机体的某些疾病变化，从
23、而作为疾病诊断的依据 6-8 。此外，Exosome形成后，既可以分布在分泌细胞周围，也可以通过血液和体液迁移到其它部位。但是，由于 Exosome体积小、密度低，不易获取，一定程度上制约了人们对它的研究。Exosome的分离方法众多，如滤膜过滤法、蔗糖梯度离心法、免疫磁珠法、色谱法等，其中以超速离心法最为常用，但其耗时长、对设备和人员要求高，在临床应用中可操作性较差。本研究选用 ExoQuick沉淀试剂进行血清 Exosome分离，操作简便、省时。此外，也有研究者对血清、尿液 Exosome的多种分离方法分别进行了比较，结果发现用 ExoQuick沉淀试剂分离到的 Exosome含量最高，适
24、于进行 RNA检测；而超速离心法分离到的 Exosome则更适于进行蛋白质分析 9, 10 。Exosome有其独特的特性。透射电镜下，Exosome 呈圆形或椭圆形低电子密度囊泡，包膜完整，直径约 40-100nm，密度介于 1.10-1.18g/mL之间。本研究中观察到的血清 Exosome与之形态一致。此外，虽然不同细胞来源的Exosome中所含成分不尽相同，但由于都来自晚期核内体，几乎所有 Exosome的形成都需要热休克蛋白（HSP） 、四跨膜蛋白（CD63 ，CD9，CD81 和 CD82） 、MHC I 类或 II 类分子、整合素、细胞骨架蛋白及一些生物酶类的参与 11, 12
25、，因此，人们 通常将这些特异的蛋白质作为区分和鉴定 Exosome的分子标志物。本研究中我们选用热休克蛋白 HSP70和四跨膜蛋白 CD63作为人血清来源Comment U7: 是 miRNA分泌的唯一方式吗？与下文“提示血清中的循环 miRNA可能主要来自 Exosome”会否不统一？Comment U8: 与细胞通过 Exosome包裹分泌 miRNA7Exosome的鉴定指标。Western Blot结果表明，用 ExoQuick从人血清中分离出的 Exosome可检测到这两种蛋白标志物，从而进一步证实了血清 Exosome的存在和该分离方法的可靠性。miRNA是一类 19-24个核苷酸
26、的内源性非编码单链 RNA分子，生物信息学预测表明，miRNA 能调控超过 60%的基因，在细胞发育、分化、增殖、凋亡、迁移及代谢等多种过程中都有重要作用 13 。自 2008年从血清和血浆中分离出循环 miRNA以来，越来越多的研究表明，miRNA 可以稳定存在于多种体液中，细胞外 miRNA的异常表达与人类的机体变化密切相关，有望成为多种疾病的生物标志物 14, 15 ，但由于外周血中循环 miRNA含量低，导致临床应用受到极大限制。细胞外 miRNA稳定性和起源的研究表明，细胞通过 Exosome包裹分泌出 miRNA，同时 Exosome中的 miRNA比细胞内呈现出更高的浓度 3,
27、16, 17。为确认血清 Exosome中 miRNA的含量和质量，我们采用 Agilent 2100生物分析仪对 Exosomal RNA进行了鉴定，结果表明其中的 RNA组分主要为约 25nt的小 RNA，提示可能系 miRNA。随后我们确认了了 4种已报道 miRNA（miR-16，miR-21，miR-20a，let-7a） 10, 18的确在 Exosome中有表达，并发现Exosome沉淀中 miRNA含量显著高于全血清样本中和去除 Exosome的上清，提示血清中的循环 miRNA可能主要来自 Exosome。因此，分离血清 Exosome有利于提高循环 miRNA的检出。miR
28、NA是多种疾病，特别是多种肿瘤的良好标志物，进一步探讨疾病过程中 Exosome miRNA的表达差异，有可能为其临床检测提供有效的手段。另一方面，对 Exosomal miRNA的分泌机制的研究尚处于探索初期，要想进一步明确其临床应用价值，还有很长一段路要走。但随着研究的不断深入，Exosome必将会有广阔的临床应用前景。参 考 文 献1 Mitchell P S, Parkin R K, Kroh E M, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.J. Proc Natl
29、 Acad Sci US A,2008,105:10513-10518.2 Lee Y, El A S, Wood M J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.J. Hum Mol Genet,2012,21:R125-8R134.3 Valadi H, Ekstrom K, Bossios A, et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel
30、 mechanism of genetic exchange between cells.J. Nat Cell Biol,2007,9:654-659.4 Taylor D D, Gercel-Taylor C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.J. Gynecol Oncol,2008,110:13-21.5 Johnstone R M, Adam M, Hammond J R, et al. Vesicle formation during r
31、eticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).J. J Biol Chem,1987,262:9412-9420.6 Feng D, Zhao W L, Ye Y Y, et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis.J. Traffic,2010,11:675-687.7 Mathivanan S, Simpson R J. ExoCarta:
32、A compendium of exosomal proteins and RNA.J. Proteomics,2009,9:4997-5000.8 Keller S, Ridinger J, Rupp A K, et al. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics.J. J Transl Med,2011,9:86.9 Alvarez M L, Khosroheidari M, Kanchi R R, et al. Comparison of protein, microRNA, and
33、 mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.J. Kidney Int,2012,82:1024-1032.10 Rekker K, Saare M, Roost A M, et al. Comparison of serum exosome isolation methods for microRNA profiling.J. Clin Biochem,2014,47:135-138.11 Gastpar R,
34、Gehrmann M, Bausero M A, et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells.J. Cancer Res,2005,65:5238-5247.12 Logozzi M, De Milito A, Lugini L, et al. High levels of exosomes expressing CD63 and caveolin-1 in plasma of mel
35、anoma patients.J. PLoS One,2009,4:e5219.13 Bentwich I, Avniel A, Karov Y, et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs.J. Nat Genet,2005,37:766-770.14 Zen K, Zhang C Y. Circulating microRNAs: a novel class of biomarkers to diagnose and monitor human cancers.J. Med
36、Res Rev,2012,32:326-348.15 Russo F, Di Bella S, Nigita G, et al. miRandola: extracellular circulating 9microRNAs database.J. PLoS One,2012,7:e47786.16 Skog J, Wurdinger T, Van Rijn S, et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic bioma
37、rkers.J. Nat Cell Biol,2008,10:1470-1476.17 Mittelbrunn M, Gutierrez-Vazquez C, Villarroya-Beltri C, et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.J. Nat Commun,2011,2:282.18 Arroyo J D, Chevillet J R, Kroh E M, et al. Argonaute2 complexes carry
38、a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.J. Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108:5003-5008.10图1 血清Exosome 的透射电镜鉴定图11图 2 血清 Exosome 的 NanoSight LM10-HS 分析仪鉴定图12注：A 图中， 1：Exosome；2：去除 exosome 的血清上清液图 3 血清 Exosome 的 Western blot 鉴定和 RNA 质量分析图13图 4 血清 Exosome 中 miRNA 的表达分析14注： ：Exosome；：全血清；：去除 Exosome 的血清上清液（P0.05, P0.001）图 5 血清各组分中的 miRNA 含量比较
