1、蛋白质组学技术与妊娠相关疾病的研究进展国外医学妇产科学分册 2006 年 33 卷第 3 期综述产科疾病及其相关研究蛋白质组学技术与妊娠相关疾病的研究进展中南大学湘雅三医院妇产科(410013)马薇综述周昌菊审校?l53?摘要蛋白质组学(proteomics)是从整体水平研究细胞内动态变化的蛋白质组成成分,表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,解释蛋白质功能与细胞生命活动的规律.蛋白质组学技术在临床医学研究领域主要侧重于疾病的发生机制,预防,早期诊断和治疗,寻找疾病的生物标志物以及治疗靶点的研究.就其在妊娠相关疾病如妊娠合并感染,早产,子痫前期,妊娠滋养细胞疾病的研究进展作综述.
2、关键词蛋白质组学技术妊娠合并感染早产子痫前期妊娠滋养细胞疾病蛋白质是生命活动的主要执行者.蛋白质组学研究基因组在不同时间和空间编码的全部蛋白质的组成及作用规律.在组织细胞的整体蛋白质水平上揭示生命活动的基本规律,获得对细胞生理,病理过程及调控网络的全面而深入的认识作为基因组学研究的拓展.蛋白质组学研究成为世界生命科学领域的一个极其活跃的部分.是功能基因组时代或“ 后基因组时代“ 的核心部分 【l1.蛋白质组学技术为研究细胞或组织中的蛋白质的表达情况提供了一种高通量,全面,快速的分析平台,成为生物医学领域探索性研究的强有力工具.妊娠和分娩的成功进展依赖于生物分子之间的相互作用,尤与子宫局部微环境
3、息息相关.这些生物分子的表达具有组织和阶段特异性.受体内外环境多种因素影响.一些妊娠相关疾病如感染,早产,子痫前期,妊娠滋养细胞疾病等与孕产妇和围生儿的发病率和死亡率直接相关虽然这类疾病的相关研究广泛.但进展甚微.临床对于适时诊断和积极治疗这些疾病仍有一定困难.随着双向凝胶电泳(two dimensionalelectrophoresis.2 一 DE)技术的飞速发展和现代生物信息技术的日新月异.应用蛋白质组学技术揭开生命奥秘完全可能实现蛋白质组学研究及其支撑技术“蛋白质组“ 一词的英文是 PROTEOME.是PROTEins 和 genOME 的组合.意思是 proteinsexpresse
4、dbyagenome,即为基因组表达的蛋白质21.这概念由澳大利亚的 Wilkins 和 Williams 于 1994 年基金项目:湖南省卫生厅科(B2oo5068);中南大学湘雅三医院博士化基金(编号:0529)现工作单位:西北民族大学医学院收稿日期:20051128 修回日期:2006-0313提出,1995 年 7 月首次在电泳杂志上发表.该定义为由单个细胞,器官或组织类型所表达的全部蛋白质.其对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体,而不是局限于一个或几个蛋白质.由于同一基因组在不同细胞,不同组织中的蛋白质表达情况各不相同,即使是同一细胞,在不同的发育阶段,不同的生理条件甚至不同的环境
5、影响下.其蛋白质的存在状态也不尽相同.因此,蛋白质组是在空间和时间动态变化的整体.蛋白质组学则是应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的一门学科.是对基因组所表达的整套蛋白质的分析.现阶段.蛋白质组学研究的内容不仅包括对各种蛋白质的识别和量化,还包括确定其在细胞内外的定位,修饰,相互反应,活性以及最终确定功能.并对由此获取的数据进行数据库构建及进行相关分析技术的研究蛋白质组学研究的支撑技术主要有 2 一 DE 技术即蛋白质分离技术和以质谱为代表的蛋白质鉴定技术以及生物信息学技术.其主要技术步骤包括蛋白质样品的制备,蛋白质和肽的分离以及蛋白质定量分析和鉴定.当前蛋白质组的研究可分为两个阶段:
6、第一阶段是建立一个细胞或一个组织或一个机体在“正常 “条件下的蛋白质二维凝胶图谱.或称参考图谱,即所谓“组成蛋白质组 “.第二阶段则要研究在各种条件下蛋白质组的变化.从中总结出生命活动规律,可称为“功能蛋白质组 “.蛋白质组学技术在妊娠相关疾病中的研究进展一,妊娠合并感染在蛋白质水平对病原微生物引起的生殖系统感染性疾病的研究为数不多.妊娠妇女感染弓形虫后可通过垂直传播给胎儿,造成畸胎,死胎及视网膜脉?154?络膜炎等严重后果 Jungblut 等3用 2-DE 并银染法结合免疫杂交技术分析弓形虫感染患者血清.比较急性感染期的妊娠,非妊娠和潜伏期患者血清蛋白质.发现 9 种蛋白质出现于所有的血清
7、中.其中 7 种蛋白质在疾病的不同时期有明显差别.因此.联合检测多种抗原有助于区别弓形虫感染的急性期和潜伏期.发现的 7 种抗原可作为候选诊断标志物最近.Buhimschi 等41 应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDITOFMS)鉴定 104 例妊娠妇女羊水中羊膜腔感染(IAI)的特异性生物标志物.发现早产合并 IAI 的羊水中存在 34 种特异性蛋白质:人类中性粒细胞蛋白肽 1(humanneutrophilpeptide1,HNP1)和 2(HNP2,又称防御素),钙颗粒素 A(calgranulinsA,CalA)和 CalC.根据羊水中4 种蛋白质表达或缺失设计了 MR
8、 评分 fmassrestrletedscores).分值从 0 分(4 种蛋白质表达均缺失)至 4 分(4 种蛋白质均表达).试验包括:对已知有早产症状和妊娠结局妊娠妇女羊水进行检测.寻找 IAI 特异性蛋白质 . 随机双盲试验.根据羊水中蛋白质的 MR 评分预测妊娠结局 .结果:根据MR 评分2 分发现 IAI 的敏感性 92.9%.特异性91.8%.根据 MR2 分发现 IAI 的敏感性和特异性均为 100%,且 MR2 分与难免早产密切相关由此认为羊水中这 4 种蛋白质的表达对识别 IAI 具有重要意义.但仍需大规模临床试验验证.研究者【s1继续应用酶联免疫吸附实验(ELISA)和 S
9、ELDI 同时对 IAI 患者和正常妊娠妇女羊水样本进行上述生物标志物检测发现:IAI 与 HNP13,CalC 的表达水平上调相关.而 CalA 单体因缺乏相应 ELISA 抗体无法检测.只能检测到钙卫蛋白(calprotectin.一种calA 和 CalB 的复合物). 认为 SEIDI 仍然是目前惟一可以鉴别蛋白质亚型的可靠方法另有学者61应用 SELDITOF.MS 技术对 IAI 的家兔模型研究发现 IAI 特异标志物 :Ca1.C 和钙周期蛋白(Calcyclin).因为钙颗粒素是 S100 钙结合蛋白家族成员 .两位学者均认为 S100 可能参与了 IAI 的宿主免疫反应二,早
10、产胎膜早破正常妊娠羊水压力和完整性是人类胚胎正常发育的基本条件.羊水性状发生改变同胎儿,胎盘和羊膜腔功能的完整性密切相关早产胎膜早破是早产临产前的危机.常并发感染和难产利用基因组学和蛋白质组学技术.应用互补 DNA 分析以及对胎膜进行量化的免疫细胞化学研究发现.早产胎膜早破病例中胎儿生长发育的调节通路,细胞外基质(ECM)国外医学妇产科学分册 2006 年 33 卷第 3 期重塑和蜕膜炎症反应均发生了变化Thadikkaran 等 171 取妊娠 17 周和足月妊娠妇女羊水和血清进行蛋白质组学研究.发现羊水样本在等电点(PI) 为 2.57.分子质量介于 1250ku 的区域有 27 个蛋白质
11、斑点表达.而在母体血清中其表达缺失此外.尚有 9 个蛋白质斑点在 4 个 17 妊娠周羊水样本胶条上清晰可见.经过考马斯亮兰染色后发现有 5 个蛋白质在 2 一 DE 凝胶上表达明显通过质谱鉴定.3 个与蛋白质片段相关的斑点是已知的蛋白多肽.在正常血清中有表达.另外 2 个与蛋白质片段相关的斑点分别为聚焦蛋白(an)片段(近似分子质量为 19.1ku.PI 为 5.3)和基底膜蛋白多糖(perlecan)片段(近似分子质量为 19.6ku,PI 为 5.62).两种蛋白质均在妊娠 17 和 40 周的羊水中表达.而在相应的血清中不表达聚焦蛋 I(swissprot:O004681和基底膜蛋白多
12、糖 fSWissprot:P98160)均为大分子质量硫酸乙酰肝素蛋白聚糖.通过增加基底膜蛋白多糖抗体验证其羧基端片段.蛋白质印迹证实其仅在羊水中表达有证据表明硫酸乙酰肝素蛋白聚糖参与胎儿的发育,促进对滋养细胞的植入.Grayett 等【sl 应用 SELDI 对有亚临床绒毛膜羊膜炎的患者和灵长类动物羊水差异蛋白峰进行识别.随后应用液相色谱仪串联质谱法(LC.MS/MS) 对标本胶条和蛋白质印迹验证的胶条对蛋白片段进行鉴定.最后得出结论:胰岛素样生长因子结合蛋白 1(IGFBP 一 1)和 calB 是羊膜腔感染的特异性生物标志物.羊水中 IGFBP 一 1 在妊娠中三月(13 24 周) 阶
13、段.即当羊膜与绒毛一蜕膜相互融合时即可检测到且在宫颈阴道分泌物中找到 IGFBP 一 1 亚型.可以预测宫内感染,胎膜早破和产褥病率.calB 与羊膜腔感染无关.但其作为一种炎性蛋白.可能与分娩的启动有一定关系三,子痫前期子痫前期是导致孕产妇死亡和围产儿发病率及死亡率升高的最主要原因之一世界范围内 3%10%的妊娠发生子痫前期该病病情发展迅速且无法在早期进行预测多认为病因与滋养细胞浅着床和胎盘功能异常有关.目前.子痫前期的蛋白质组学研究主要集中在寻找疾病早期特异性蛋白质标志物1.胎盘肽随着分子生物学发展.已认识到多种信号传导系统可调节滋养细胞分化妊娠早期.滋养细胞的增生,分化,凋亡与氧张力功能
14、有关,在低氧状态下胎盘内血流受到影Ntl0j 低浓度氧张力通过转录.缺氧诱导因子 1(transcriptionfactot国外医学妇产科学分册 2006 年 33 卷第 3 期hypoxia-induciblefactor-11 和转化生长因子(TGF)133影响滋养细胞分化.Hoang 等【l】1 应用 2-DE 和质谱测量串联法对体外培养的滋养细胞蛋白质进行分析.通过降低氧张力使子痫前期缺氧状态发生改变.发现胶条上不足 3%的蛋白表达发生变化.提示人为操作的保护机制可对抗氧化应激同时发现子痫前期模型中存在抗氧化剂的低调和糖酵解酶的增加Than 等【l2 】 报道缺氧状态下 .膜联蛋白(a
15、nnexin )的表达显着增高.这种与细胞增殖和纤维蛋白溶解作用密切相关的蛋白质可结合胎盘蛋白 13(placentalprotein.ppl3)/半乳凝素 13(galectin13),可能其二聚体的形成与胎盘氧改变相关 Sawicki 等【l3 】研究发现足月妊娠胎盘滋养细胞缺氧调节使神经激肽 B 发生改变这种胎盘肽在子痫前期的妊娠妇女滋养细胞中显着表达研究发现神经激肽 B 可以抑制那些抗缺氧蛋白质(包括 annexin)的表达.参与血液凝固,炎症反应,感染,凋亡及其他细胞过程.对于其更进一步的研究.有助于阐明子痫前期发病机制.2.血清标志物 Tinnakorn 等【明 2-DE 及蛋白质
16、谱法.BahtivarMert 等151 用基质辅助激光解析电离技术(MALDI)均证实.子痫前期的患者与正常妊娠妇女血清中蛋白质的表达明显不同 Watanabe 等对6 例子痫前期患者和 6 例正常产妇血清进行蛋白质组学研究分析.子痫前期患者血清中丛生蛋白(C1usterin)水平升高.认为对血清中蛋白质的分析有助于研究子痫前期的病理生理 Koy 等旧用细胞切割质谱分析法对 HELLP 综合征患者分娩前后的外周血清及对照组(正常妊娠和未妊娠妇女)外周血清研究发现.对样品分析发现 HELLP 患者血清分子质量为 11.8ku 的离子信号强表达.该物质与血清淀粉样蛋白 A(serumamyloi
17、dA.SAA)非常相似.而对照组表达缺失其他离子信号差异的峰值分别为14.0.28.1,50.5 和 74.5ku.实验敏感性为 87.5%.特异性为 100%筛选实验阳性预测值为 100%.阴性预测值为 95.6%.3.脑脊液 Norwitz 等 ll8】 对 7 例子痫前期重度(sPE),8 例轻度(mPE)患者和 8 例血压正常妊娠妇女的脑脊液进行蛋白质组学研究分析应用差异蛋白鉴定技术证实匹配的蛋白峰值为血红蛋白(Hb)的 d 链和 B 链.ELISA 分析证实临床诊断 sPE 组患者脑脊液中 Hb 浓度显着高于 mPE 组和正常妊娠妇女组.因此认为:脑脊液蛋白质组学标志物可以将sPE
18、患者从 roPE 患者和正常妊娠妇女中鉴别出来sPE 患者的脑脊液中存在纳摩尔级的游离 Hb 分子?l55?四,妊娠滋养细胞疾病生理情况下.滋养细胞植入到子宫内膜和子宫间质的 ECM 受精细的调节该调节作用对维持正常胎盘完整 l 生和良好妊娠结局至关重要不受控制的“着床 “将会导致妊娠滋养细胞疾病的发生.而着床过浅又与胎儿生长受限和子痫前期相关Batorfi 等【l9l 用激光显微切割法 (1asercapturemic.rodissection.LCM)与 SEIDI-TOF-MS 联合处理并分析正常胎盘与葡萄胎胎盘组织中蛋白质组的表达结果显示葡萄胎胎盘组织的蛋白质组图谱上分子质量为 11.
19、3.13.8 和 14.0ku 的 3 种金属结合多肽的表达量明显少于对照组认为进一步研究两者表达差异的蛋白质有助于探讨妊娠滋养细胞疾病的发病机制.Vorum 等201 对高氧环境(95%0: 和 5%CO)和标准环境(21%0 和 5%CO)培养人绒毛膜癌细胞株JEG 一 3 进行蛋白质组学分析发现在高氧环境下JEG 一 3 细胞中有 13 个蛋白质斑点表达下调应用MALDITOF 技术分析 10 个阳性表达的蛋白质斑点.发现了 9 个特异性蛋白质:绒毛蛋白 2(Villin2),B 微管蛋白 (1ublinbeta),肌动蛋白结合蛋白 I(profilinD,3 一磷酸甘油醛脱氢酶(gly
20、ceraldehyde 一 3 一 phosphatedehydrogenase).磷酸甘油酸变位酶 (phosphoglycerateinutase).过氧化物还原酶 1(peroxiredoxin1).neuroplpeptideh3.多聚 C 结合蛋白 1(poly(rC)一 bindingprotein1)和环孢亲和素 A(cyclophilinA).这些蛋白质均参与了细胞骨架结构,糖酵解,氧化一还原反应,细胞信号传导,转录和蛋白质折叠的调节.在介导氧应激中的细胞反应和调节细胞增殖和运动作用中具重要作用对滋养细胞正常植入和异常增殖的分子机制研究有助于认识妊娠滋养细胞疾病发生机理和判断预
21、后展望目前用于妊娠相关疾病发生和预后的早期预测研究很多.但在实际应用中效果并不理想.因此 l 临床上亟需建立一种新的更具可信度和特异性的围生期筛查方法利用蛋白质组学技术结合基因组学方法和生物信息学.寻找妊娠相关疾病的特异性生物标志物有望实现此目标然而.蛋白质组学技术也面临许多挑战.需要多方面地进行检验细胞组成成分,生物学行为和功能.质谱分析的低敏感性,低拷贝的蛋白质鉴定等仍是面临的主要难题参考文献lTyersM,MannM.Fromgenomicstoproteomics.Nature,2003,422(69281:193?197?156?2AndemonNLAndemonNG.Proteom
22、eandproteomics:newtechnologies,newconcepts,andnewwords.Eleelrophoresis,1998,19(11):1853?18613JungblutPR,ZimnyAmdtU,ZeindlEberhartE,ela1.Protecmicinhumandi8PAtSeS:cancer.heartandinfectiousdi 目 Ises.Eleelrophoresis,199l9.20(1o1:21O2l1O4BuhimschiIA,ChristnerR,BuhimschiCS,eta1.Proteomicbiomarkeranalysis
23、ofamnioticfluidforidentificationofintra-amnioticinflammation.BJOG,20,l12(2):1731815BuhimschiIA.BuhimschiCS,WeinerCP,eta1.ProteomicbutnotenzymelinkediramunosorbentassaytechnologydetectsamnioticfluidmonomericcalgranulinsfromtheircomplexedcalprotectinfoFil1.ClinDiagnLabImmunol,2005.2(7):8378446K1einLL.
24、FreitagBC.GibbsRS.eta1.Detectionofintraamnioticinfectioninarabbitmodelbyproteomicsbasedamnioticfluidanalysis.AmJObstetGynecol,2005,193(4】:1302-13O67kkaranL.CrettasD,SiegenthalerMA,ela1.rI11eroleofproteomicsintheassessmentofprematureruptureofletalmembranes.ClinChimAeta.20.60(12):27.368GravettMG,NovyM3,RosenfeldRG,eta1.Diagnosisofintra-amnioticinfectionbyproteomicprofilingandidentificationofnovel
