1、固定化酶生产低乳糖牛乳的研究现代食品科技 ModernFoodScienceandTechnology2008,Vo1.24,No.8固定化酶生产低乳糖牛乳的研究王静,贾英民,邹磊, 苗立军, 彭红丽,鲁凤娟(1.中国环境管理干部学院生态学系,河北秦皇岛 066004)(2.河北农业大学食品科技学院,河北保定 071001),摘要:以离子交换树脂 D151 为载体,采用吸附交联法固定化黑曲霉来源乳糖酶,并将固定化酶装填于填充床反应器中处理牛乳,研究固定化酶连续生产低乳糖乳的条件和使用稳定性.试验结果表明:在 50下,牛乳以 0.53mL/min 的流速通过反应器生产低乳糖乳效果最好,可获得 7
2、9.7%的乳糖水解率,达到低乳糖乳的要求.固定化酶在最适条件下连续水解牛乳,每隔 20h 用 pH6.5 缓冲液清洗反应柱,其 10d 内酶活力丧失 12%,此时乳糖水解率为 70.1%,达到低乳糖乳的要求.固定化乳糖酶连续使用半袁期约为 22d.该研究为工业化利用固定化酶连续生产低乳糖乳提供了技术依据.关键词:固定化酶连续生产;低乳糖乳中图分类号:Q814.2;文献标识码:A;文章篇号:16739078(2008)08 079104Producti0n0fLOW.1actoseMilkwithImmobilizedEnzymeWANGJing1,姒 Ying.min,z0uLeiMIA0L-
3、junI,PENGHong-li,LuFeng-juan(1.DepartmentofEcology,EnvironmentmanagementofcoUegeinchina,Qinhuangdao066004,China)(2.DepartmentofFoodScienceandTechnology,AgricultureUniversityofHebei,Baoding071001,China)Abstract:ThelactasefromAspergillusnigerwasimmobilizedonthecartierofKation-exchangeresinD151byabsorp
4、tionandcrosslinking.Thecontinuousproductionconditionsoflowlactosemilkandtheusagestabilityoftheimmobilizedlactaseinthefilled-bedreactor,ereresearched.Resultshowedthat,forcontinuousproductionoflow lactosemilkinthefilled-bedreactor,thebestvelocityandreactiontemperaturewere0.53mLlminand50,respectively,u
5、nderwhichthehydrolysisrateoflactosereached79.7%,meetingtherequestoflowlactosemilkproduction.Aftera10 一daycontinuousoperationofthecolumnpackedwithimmobilizedenzymeunderthebestconditionsandawashofthecolunlnusingbuffer(pH6.51per20h,12%ofinitialenzymeactivitywaslostandthehydrolysisrateoflactosewas70.1%.
6、Thehalf-lifeofimmobilizedenzymeWasabout22days.Thisresearchprovidedthetechnicalfoundationrtheindustrialcontinuousproductionoflowlactosemilkbyimmobilizedlactase.Keywords:immobilizedenzyme;conlSnuousproduction;low.lactosemilk牛乳中乳糖含量为 4.7%,占干物质的 3839%乳糖不耐症的人饮用牛乳后,易引起涨气,肠痉挛,腹泻等消化不良症状.利用乳糖酶水解牛乳中70%90%的乳糖(
7、一般水解 70%80%乳糖为最佳选择)生产低乳糖乳制品,可有效解决“乳糖不耐症“ 问题.随着酶固定化技术的发展,美国,日本和意大利等国早在 1972 年之前已将固定化乳糖酶用于低乳糖制品的生产,并应用于政府实施的“学生奶计划“ 之中J.中国乳糖酶的固定化研究较晚,到 2001 年为止,利用固定化乳糖酶工业化生产低乳糖乳制品在中国收稿日期:200804.27基金项目:河北省农副产品加工重大攻关专项(03220173D)作者简介:王静(1978.), 女, 硕士,助教,主要从事食品微生物方面的研究还未见产品6】o 随着我国乳品工业的发展,开展乳糖酶在乳品工业中的应用研究,对于推动我国乳品工业的发展
8、具有一定意义.1 材料与方法1.1 主要试验材料1.1.1 试验菌株黑曲霉 UCo 一 3,由河北农业大学食品科技学院生物工程系酶工程实验室提供.1.1.2 主要试剂大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂 D151(南开大学化工厂);50% 戊二醛( 北京化学试剂三厂);葡萄糖测定试剂盒(保定长城试剂公司);新鲜牛乳(市售);其它试剂均为国产分析纯和化学纯.1.2 试验方法79l现代食品科技1.2.1 乳糖酶酶液制备ModernFoodScienceandTechnology2008,Vo1.24,No.8菌株经过活化后,接种于发酵罐中发酵培养,收集发酵液.粗酶液经过四层纱布过滤,双层滤纸抽滤,超滤
9、浓缩后,6000r/rain 冷冻离心 10rain,取上清酶液于 4冰箱保存备用.1.2.2 固定化酶制备采用吸附交联法,戊二醛为交联剂.制备过程如下:取经酸碱交替处理的 D151 树脂加入用 pH4.00I3mol/L 醋酸缓冲液稀释的乳糖酶酶液(加酶量为 70U/g(载体),在 25吸附 24h 后加入 4%戊二醛,在30下交联 6h,制得固定化酶经蒸馏水洗涤后备用.1.2.3 酶活力测定取一定量固定化酶,加入 2mLpH4.05%乳糖醋酸缓冲液(55 预热 5rain),在 55水浴中振荡反应 15rain 后,于沸水浴中热处理 3rain,吸取 30酶催化反应液加入盛有 1.5mL
10、葡萄糖测定试剂盒的试管中,37水浴反应 15min,测定葡萄糖生成量.在上述条件下,每分钟水解产生 1tmol 葡萄糖的酶量定义为一个酶活力单位(U).1.2.4 牛乳中乳糖含量的测定将新鲜牛乳煮制 5rain,冷却后除去表层脂肪,采用直接滴定法测定乳糖含量.1.2.5 低乳糖乳的连续生产在内径 101TI1TI 高度 400mm 的夹套式柱状玻璃反应器的夹套中通入蒸馏水,以超级叵温水浴保持温度.取 20g 湿态固定化酶加入反应器中,连接蠕动泵和部分收集器,恒温后调节蠕动泵速度分别以不同体积流速(2.120.35mL/min)从反应器上端进料,经预热段后进入酶床,并从反应器底部流出.调节收集器
11、以酶床体积的 l/5 为间隔收集流出液,测定其生成的葡萄糖量,根据其葡萄糖含量变化确定酶水解达到稳态的时间.根据酶水解达到稳态时生成的葡萄糖量,计算牛乳中乳糖的水解率,反应器生产效率和固定化酶生产效率.1.2.6 计算方法参照文献 J,并加以改进.(1)乳糖水解率/o/0= 葡萄糖质量 /牛乳中原乳糖质量 X100.,(2)反应器生产效率/(mg?rain1.mL-(酶柱体积)=(牛乳水解液的葡萄糖浓度 x2x 底物流速)/酶柱体积.(3)固定化酶生产效率/(rag?min-1.g-(湿酶)=(牛乳水解液的葡萄糖浓度 x2x 底物流速)/装酶量.7922 结果与讨论生鲜牛乳经煮制 5rain,
12、冷却除去表层脂肪,预热后以不同底物流速(空间流速,保留时间)通过固定化酶柱进行水解,达到稳态反应后取样测定水解牛乳中葡萄糖含量,计算牛乳中乳糖的水解率,固定化酶生产效率和反应器生产效率.2.1 温度对牛乳中乳糖水解效果的影响甜保留时间/min图 1 不同温度下保留时间对乳糖水解率的影响Fig.1Effectoftheretentiontimeonhydrolysisrateoflactoseatdifferenttemperature图 l 可看出固定化酶反应器的操作温度对乳糖水解率影响显着.60的乳糖水解率始终低于 50.40的水解效果低于 50水解效果,在保留时间 20rain,40rai
13、n,60rain 时其水解率分别低 22.0%,20.6%,16.5%,表现出随保留时间的增加水解效果差别减小的趋势.这可能是因为保留时间的增加导致扩散限制增加而影响了酶活性,高温时水解率高因其产物抑制要高于低温时的水解,因此其差别减小.,.,髓舀函:,I;L较I=L侏硝时间/min图 2 不同温度下保留时间对固定化酶生产效率的影响Fig.2Effectoftheretentionlimeonproductionefficiencyofimmobilizedenzymeatdifferenttemperature图 2 可看出随着保留时间的增加,固定化酶生产效率呈现降低趋势.60的保留时间在低
14、于 40rain时其生产效率明显高于 40,高于 40min 时固定化酶生产效率与 40相比差别较小;60与 50相比其固定酶生产效率始终较低,并且随保留时间的增加差距增大,这可能是由于酶在高温下逐渐失活而导致.现代食品科技 ModernFoodScienceandTechnology2008,Vo1.24,No.8综合温度对乳糖水解率和固定化酶生产效率两个因素的影响,最终确定 50为在填充床反应器中能牛乳水解生产低乳糖乳的适宜温度,在该温度下生产低乳糖乳也能很大程度上抑制杂菌的生长.2.2 保留时间对牛乳中乳糖水解率的影响保留时间/rain图 3 最适温度条件下保留时间对乳糖水解率的影响ri
15、g.3Effectoftheretentiontimeonhydrolysisrateoflactoseatthebesttemperature在 50下研究不同保留时间对牛乳中乳糖水解率的影响,如图 3 所示.从图 3 可看出,保留时间对牛乳的水解效果有明显影响.在保留时间较短时(即高底物流速),随保留时间的增加水解率迅速增加,但增速随保留时间的继续增加而变缓,当保留时间大于40min(底物流速小于 0.53mL/min)时,保留时间再增加,水解率增加很小.这主要是由于保留时间的增加即底物流速的降低,使得反应产物不能及时地从柱中流出,固定化酶受扩散限制效应的影响导致活性降低,因此在进行操作时
16、必须综合考虑,选择合适的保留时间(底物流速). 单从这一因素考虑时,从图 3可以确定牛乳的保留时间以 40rain 为最好,此时固定化酶反应器生产效率为 0.93mg?rain-1.mEJ(酶柱体积),固定化酶生产效率为 0.99mg?man-1.g-(湿酶),乳糖水解率为 79.7%,此时既达到了低乳糖乳的要求,剩余乳糖又能发挥原有的营养保健作用.2.3 填充床反应器连续操作稳定性固定化酶装柱以流速 0.53mL/min,在 50条件下连续水解牛乳的试验结果如图 4 所示.由图 4 可知,在固定化酶填充床反应器中,连续水解乳糖 20h 后,由于产物在固定化酶内部大量积累,酶水解乳糖的能力降低
17、,乳糖水解率从最初的 79.7%下降到 71%,用 pH6.5 缓冲液清洗反应柱,可使酶活力恢复到初始酶活力的 99.2%,此时乳糖水解率为79.1o/0,固定化乳糖酶水解乳糖的能力得到提高.经试验验证乳糖酶催化反应产物对乳糖酶的水解有抑制作用,而且这种酶失活是可逆的,当酶内部的产物被洗出后,就能恢复大部分酶活力.祷连续反应时间/h图 4 填充床反应器在最适条件下生产低乳糖乳的稳定性研究Fig.4Thestabilityofthefilledbedreactorintheproductionoflow-lactosemilkunderthebestconditions得时间/d图 5 填充床反
18、应器中固定化乳糖酶的操作半衰期研究Fig.5Thehaft-lifeofimmobilizedenzymeinfilledbedreactor固定化酶装柱以流速 0.53mL/min,在 50条件下连续水解牛乳,每反应 20h 用 pH6.5 缓冲液清洗反应柱后再重新进料反应,填充床反应器连续水解牛乳生产低乳糖乳的操作半衰期如图 5 所示.试验结果表明,在上述条件下,最大底物水解率为 79.7%,固定化酶在 10d 内酶活力丧失 12%,此时对牛乳中乳糖的水解率为 70.1%,在此时间段内生产的乳糖水解乳符合低乳糖乳的要求.固定化乳糖酶连续使用 22d 后,乳糖水解率下降到初始水解率的一半,固
19、定化酶连续使用半衰期约为 22d,这为工业化利用固定化黑曲霉乳糖酶生产低乳糖乳制品提供了可靠的技术依据,使解决乳糖不耐受问题成为可能.3 结论在填充床反应器中,固定化酶连续生产低乳糖乳的最佳条件为:温度为 50,底物流速为 0.53mL/min,可获得 79.7%的乳糖水解率,达到低乳糖乳的要求.固定化酶装柱以流速 0.53mL/min,在 50C 条件下连续水解牛乳,每隔 20h 用 pH6.5 缓冲液清洗反应柱,固定化酶在 10d 内生产的乳糖水解乳符合低乳糖乳的要求.固定化乳糖酶连续使用半衰期约为 22d.(下转第 824 页)793现代食品科技 ModernFoodScienceand
20、Technology2008,Vo1.24,No?8由表 3 可知,上面配方的片剂基本上符合要求,在压片过程中基本上无粘冲现象,保形性好,崩解时限,二氧化碳量,pH 值这三个指标均达到或优于市面上同类产品,各种成分配比较合适.另外,根据口味和放气速度,溶解性能等的比较,最优配方是编号为5 的配方,即最优配方为:黑莓粉 41%,柠檬酸 35%,碳酸钠 24%,添加 0.2%阿斯巴甜调节甜度.2.4 其它影响因素除了黑莓粉的性质,泡腾剂的选择,工艺的选择外,泡腾片的性质还受到其它因素的影响.2.4.1 粉碎原料称取后需经过粉碎这一步,一般要求粉碎后要过 100 目筛.如果粉碎后粉末不够细的话,在压
21、片后会出现斑点,影响片剂的外观;同时,在崩解过程中,块状颗粒的崩解速度较慢,因此在放气完全后,会出现部分沉淀,影响效果.所以,在粉碎时要注意粉碎完全,并过筛,以保证原料颗粒大小均匀,方便溶解.2.4.2 混合各种原料经过粉碎过筛后就要混合到一起.混合是否均匀关系到后面压片表面是否均匀.如果混合不够均匀,特别是黑莓粉混合不均匀,则在片剂表面上会出现较明显的红色斑点,不但会影响到片剂的外观,而且也会影响到片剂溶解的效果.在溶解时,由于混合不均匀,可能会造成片剂局部溶解,而局部产生沉淀,特别是黑莓粉如果混合不均,极易造成块状沉淀,影响口味和外观.因此,各种原料混合时必须要混合得十分均匀.2.4.3
22、包装泡腾片一个很大的缺点是容易吸潮.压片后的泡腾片如果放置在空气中,很快就会吸潮变形,伴随产气.当吸潮后的泡腾片用水溶解时,会出现崩解速度慢,产气量少,沉淀多等现象.因此,压片后必须马上包装,避免接触空气,防止吸潮.3 结论黑莓泡腾片的制备最好采用直接粉末压片法,工艺流程为:其它物料粉碎过筛加入黑莓粉进行混合压片包装.最佳配方为:黑莓粉(含麦芽糊精 48%)41%,柠檬酸 35%,碳酸钠 24%,阿斯巴甜0.2%.此工艺 ,配方制作的黑莓泡腾片不易吸潮,外观不变形,崩解时限为 40S,酸甜适中,崩解后无明显沉淀.参考文献1罗延红等. 泡腾片研究进展J.西北药学杂志,2001,16(1):39402崔福德.药剂学 E 京:人民卫生出版社,20043药典委员会.中华人民共和国药典二部,北京:人们卫生出版社,2000
