1、 质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性作者：郭敏，郎明健，曾秋棠，杨汉东，闵新文 【摘要】 目的： 探讨应用阳离子脂质体 lipofectamine2000 在体转染质粒重组体基因至大鼠心肌的可行性. 方法： 构建含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP ）基因的真核表达质粒. 将 22 只雄性 SD 大鼠随机分为 4 组：阴性对照组（组，n=4），心肌注射组（组,n=6），尾静脉注射组(组，n=6)和冠状动脉灌注组（组，n=6）.分别采用心肌局部注射、尾静脉液压注射、冠状动脉灌注三种不同方式实施在体心肌转染. 组于转染后 2，14 d 时间点各随机处死 3 只大鼠，阴性对照组各处死 2 只大鼠,取心肌
2、组织作快速冰冻切片，荧光显微镜下观察 EGFP 表达情况. 结果： 在荧光显微镜下观察 EGFP 表达情况，阴性对照组隐约可见淡绿色荧光，第 2 天各转染组均可见明显的绿色荧光分布于所取心脏组织. 各转染组荧光强度与阴性对照组相比,其差异均有统计学意义(P0.05).心肌注射组和尾静脉注射组间荧光强度差异无统计学意义（P=0.17）. 冠状动脉灌注转染组荧光强度较其余两组增强 7.37 倍（P=0.013）. 第 2 周转染各组荧光强度明显减弱，与阴性对照组差异无统计学意义(P=0.41). 结论： 阳离子脂质体 lipofectamine2000 可有效的将质粒重组体通过各种方式转染心肌组织
3、，而通过冠状动脉灌注转染可以明显提高其转染效率. 【关键词】 脂质体；心肌；转染；质粒；绿色荧光蛋白质类0 引言基因治疗为心血管疾病的治疗带来了新的希望1，如何高效、稳定、安全地将目的基因转染到心肌组织是基因治疗中的关键问题. 目前，外源基因导入哺乳动物细胞的方法大致有生物方法和物理化学方法 2 种. 前者主要以病毒为载体，外源基因在宿主细胞中能长期表达，属当前基因治疗中首选的基因转染方式，但其安全性差、缺乏靶向性等缺点使其应用受到很大限制. 后者包括磷酸钙法、显微注射、电穿孔等,因其操作方法限制，不适于大量细胞的转染及基因治疗的在体研究2. 阳离子脂质体是一种非病毒制剂，由于其具有转染效率相
4、对较高、操作简易、可大规模转染及不引起特异性免疫反应等优点受到大家的关注. 本研究应用阳离子脂质体lipofectamine2000 将质粒重组体通过局部心肌注射、尾静脉注射、冠状动脉灌注转染 3 种途径转染至心肌组织，并比较其转染效率，为今后进行心肌组织在体转染的研究提供方法学参考.1 材料和方法1.1 材料 SD 雄性大鼠 22 只，体质量 150200 g,购自华中科技大学同济医学院实验动物中心. pGenesil1 质粒及感受态细胞 DH5购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司，lipofectamineTM2000 及OMEM 培养基购自 Invitrogen.1.2 方法1.2.1pG
5、enesil1 质粒重组体的构建质粒重组体 pGenesil1 的构建 A：阴性对照组；B：心肌注射组；C：尾静脉注射组；D：冠状动脉灌注转染组；E：冠状动脉灌注转染组升主动脉.图 1 转染 2 d 时各转染组 EGFP 的表达100A：阴性对照组；B：心肌注射组；C：尾静脉注射组；D：冠状动脉灌注转染组；aP0.05 vs 阴性对照组 ; bP0.05 vs 心肌注射组和尾静脉注射组.图 2 各转染组平均荧光强度比较最初基因治疗的途径集中于局部注射于靶器官. 早在 1990 年，Wollf 等10证实了将质粒 DNA 直接注射在心肌和骨骼肌，可获得外源基因的表达，从而开创了基因组织原位转染的
6、先河. 活体角膜、脊髓等是脂质体介导的在体转染良好的靶器官，而关于脂质体介导下心肌组织在体转染的报道很少. 本研究证实经局部心肌注射质粒脂质体复合物可以使大鼠心肌组织表达外源基因，但其表达效率较其他两组并无优势，究起原因可能是因为局部注射可以引起注射部位附近心肌坏死及纤维化8，从而影响转染试剂向周围组织的弥散及心肌细胞对质粒脂质体复合物的吞饮吞噬作用，另一方面由于心肌组织的结构特性，导致局部注射只能仅仅局限在一个很小的范围，难以达到临床上治疗心肌组织系统疾病的目的，大大影响了基因治疗的效果. 尾静脉注射法也是近年来在体转染常用途径，可以使质粒 DNA 广泛分布于全身各个器官. 但这种方法会将大
7、部分DNA 压入肝脏，其他部位 DNA 含量较少，有人分析这种转染可能是由于大体积 DNA 溶液快速注射到大鼠体内后在心脏发生阻塞，溶液返回来后通过肝静脉进入肝脏所致9，也有人推测质粒的吸收是通过受体介导非特异吸收的途径进入细胞的，质粒与细胞表面的接触时间较长，从而影响了转染效率10. 本研究结果表明经冠状动脉转染质粒重组体，心肌组织转染效率较心肌注射组和尾静脉注射组明显增高. 由于大鼠直接冠状动脉转染难度较大，我们采用左心室腔注射，同时阻断主动脉 5 s 的方法实施冠状动脉灌注转染11，阻断循环使心室血流在收缩期不能进入体循环，舒张期时冠状动脉内压力增加，并且在此期间大鼠心率减慢，可以相应延
8、长舒张期时间，大量血流可以经左右冠状动脉窦进入心肌微血管，如此反复多次，可以大大提高转染效率12，荧光图片也证实在升主动脉流出道位置转染效率最高. 从实践意义来讲，随着介入心脏病学的广泛开展，在做冠脉造影时可以完成基因治疗从而使冠状动脉内转染具有现实可行性.另外，在研究中我们还发现在转染 2 wk 后，3 种转染途径的转染效率均明显下降，与对照组无明显差别，可能是因为脂质体介导的活体转染毕竟是一个瞬时转染的过程，随着时间推移，外源基因最终在体内经过循环被代谢，要达到有效的转染效率需要在整个过程中反复多次进行转染.综上所述，我们认为通过局部心肌注射、尾静脉注射、冠状动脉灌注转染 3 种途径均能有效的将外源 DNA 导入宿主细胞，相比之下冠状动脉灌注转染途径具有最高的转染效率，为下一步进行心肌组织的在体转染提供了方法学参考.【
