1、华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 脂多糖对小鼠骨髓源性平滑肌祖细胞表达 CXCR4 的影响研究生：刘黎黎 导 师：阮秋蓉摘 要 目 的：通过观察脂多糖(1ipopolysaccharides，LPS) 对离体小鼠骨髓源性平滑肌祖细胞(vascular smooth progenitor muscle cell，SPC)膜表面基质细胞衍生因子受体表达的影响，探讨SDF-1/CXCR4轴在动脉粥样硬化发生和发展过程中所起的作用，从而探索抗动脉粥样硬化的可能方法。方 法：复苏本实验室已成功分选出的平滑肌祖细胞，并将其传代培养，按照实验设计分别分为六个组：正常对照组：加入普通培养基；低剂
2、量组(L组)：加入LPS终浓度为1ugmL，孵育6h；中剂量组(M组)：加入LPS终浓度为10ugmL，孵育6 h；高剂量组(H组) ：加入LPS终浓度为30ugmL，孵育6 h；12 h组：加入LPS终浓度为10ugmL，孵育12 h；24 h组：加入LPS终浓度为 10ugmL，孵育24 h。用免疫荧光染色及共聚焦激光扫描显微镜分析和蛋白免疫印迹检测平滑肌祖细胞基质细胞衍生因子受体蛋白表达，逆转录聚合酶链反应检测平滑肌祖细胞基质细胞衍生因子受体mRNA的表达，观察脂多糖对平滑肌祖细胞表达基质细胞衍生因子受体的时效和浓度关系。结 果：免疫荧光染色和共聚焦激光扫描显微镜分析测得的结果与RT-P
3、CR和Western blot检测的结果相一致，未给予脂多糖刺激的平滑肌祖细胞有基础水平的基质细胞衍生因子受体表达，脂多糖是基质细胞衍生因子受体的强诱导物。当刺激时间恒定时（6h），随着刺激浓度的增加，L组和M组的基质细胞衍生因子受体表达逐渐增强，与正常对照组相比均具有显著性差异（P0.01），H组开始下降。当刺激浓度恒定时（10ug1华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 mL），随着刺激时间的延长，M组和12h组的表达量也逐级增强，与正常对照组相比均具有显著性差异（P0.01）。在所有组中， 12h组表达最强，其mRNA和蛋白水平分别为基础水平的6.10倍和4.76倍，24h组又下
4、降，但仍高于基础水平。结 论：平滑肌祖细胞能表达低水平的CXCR4 ，动脉粥样硬化的危险因子脂多糖能够使平滑肌祖细胞的CXCR4水平上调，其作用在一定范围内呈浓度时间依赖性，提示SDF-1/CXCR4轴可能参与了平滑肌祖细胞在血管损伤部位的归巢。关键词： 动脉粥样硬化；平滑肌祖细胞；脂多糖；CXCR4 ；基质细胞衍生因子 -12华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Lipopolysaccharides On Expression Of CXCR4 In MouseBone-marrow Smooth Muscle Progenitor CellAbstractAims:Throug
5、h observing the effects of 1ipopolysaccharides on exsomatize mice spinalmarrow non-odontogenic smooth progenitor muscle cell membrane surface stroma cellsderived factor receptor expression, to discuss the role that SDF-1/CXCR4 axis plays in thedeveloping process of atherosclerosis formation, thus to
6、 seek the possible ways of antiatherosclerosis.Methods:Using enhancement type P green-fluorescing cells plasmid recombinant to select thesmooth progenitor muscle cell out from the mice marrow mesenchyma stem cells , thensubculture them and divide them into six groups as the experiments design: Norma
7、lcontrol group: add ordinary culture medium； Low dosage group(group L): finalconcentration of the LPS is 1ug/mL, incubating for 6h；Medium dosage group(group M)：final concentration of the LPS is 10ug/mL, incubating for 6h; High dosage group(groupH): final concentration of the LPS is 30ug/ mL, incubat
8、ing for 6h；group12h: finalconcentration of the LPS is 10ug/mL, incubating for 12h；group24h: final concentrationof the LPS is 10ug/mL, incubating for 24h. Use Western blotting and immunofluorescencestaining and confocal laser scanning microscope to detect smooth progenitor muscle cellmembrane surface
9、 stroma cells derived factor receptor protein expression and to use reversetranscription polymerase chain reaction to detect smooth progenitor muscle cell membranesurface stroma cells derived factor receptor mRNAs expression, thus to observe therelations between lipopolysaccharides aging and concent
10、ration when the smoothprogenitor muscle cell is expressing stroma cells derived factor receptor.3华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Results:The immunofluorescence staining and confocal laser scanning microscope method havegot the identical results with RT-PCR and Western blot detection, those smooth muscleprog
11、enitor cells that havent been given lipopolysaccharide stimulation have stroma cellsderived factor receptor expression of foundation level, lipopolysaccharide is a stronginducer of stroma cells derived factor receptor. When the stimulus time is invariable（6h）,as the increasing of the stimulus concen
12、tration, stroma cells derived factor receptorexpression of group L and group M strengthened gradually, and has significant differencewith the normal control group(P0.01), but group H began to decrease. When the stimulusconcentration is invariable（10ugmL）, as the extend of the time, the expression vo
13、lumeof group M and group 12h increased as well, and has significant difference with normalcontrol group(P0.01). In all the groups, group 12h has the strongest expression, and itsmRNA and protein level are 6.10 times and 4.76 times as the foundation level respectively,the group 24h decreased, while s
14、till higher than the foundation level.Conclusion:Smooth muscle progenitor cells can express CXCR4 of low level, Atherosclerotic riskfactors can lipopolysaccharide smooth muscle progenitor cells increases the level ofCXCR4, the effect present concentration and time-dependent, SDF-1/CXCR4 axis involve
15、din the smooth muscle progenitor cells vascular injury in the homing site.Key words:atherosclerosis；vascular smooth progenitor muscle cell；1ipopolysaccharides；CXCR4；stromal cell-derived factor-14独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和
16、集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密 ，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学
17、 位 论 文 脂多糖对小鼠骨髓源性平滑肌祖细胞表达 CXCR4 的影响研究生：刘黎黎 导 师：阮秋蓉前 言 动脉粥样硬化(atherosclerosis ,As) 是心血管系统疾病中最常见的疾病，也是危害人类健康的常见病。AS 主要累及大中动脉，其基本病理改变是动脉内膜的脂质沉积，粥样斑块形成，导致动脉管壁变硬，管腔狭窄，最后引起一系列继发缺血性的改变，特别是发生在心和脑等器官，引起严重后果。AS 的发病机制至今尚未最后阐明，学说有很多，如脂质渗入学说，巨噬细胞受体缺失学说，致平滑肌突变学说，以及损伤应答及炎症学说等。但是目前任何一种学说均不能全面解释 AS 的发生和发展。现在，AS 被公认为
18、是一种复杂的慢性炎性病变，众多的炎症细胞、平滑肌细胞、趋化因子、粘附分子等细胞因子参与在其发生发展过程。在此过程中，巨噬细胞和血管平滑肌细胞大量增生聚集摄取脂质形成巨噬细胞源性和肌源性泡沫细胞为主要特征。肌源性泡沫细胞的来源成为了 AS 发病机制中讨论的焦点之一。传统观念认为动脉中膜平滑肌细胞的增殖及迁移至内膜形成泡沫细胞。然而近期的大量研究发现平滑肌源性泡沫细胞不仅可以来源于动脉中膜，也可由来源于骨髓的平滑肌祖细胞归巢演化形成，尤其当动脉壁受到炎症等损伤后，骨髓源性的平滑肌祖细胞迁移至损伤部位并形成泡沫细胞更加明显15-18。基质细胞衍生因子-1a( stromal cell-derived
19、 factor-1 alpha ,SDF-1a)是一种趋化因子，能介导血液中的炎症细胞与内皮细胞的粘附并向血管内膜下迁移。CXCR4 作为SDF-1 特异性的受体与其形成 SDF-1/CXCR4 反应轴，越来越多的研究表明此轴与动脉粥样硬化相关1-3。CXCR4 表达于多种细胞表面，如巨噬细胞，淋巴细胞，造血干细胞，骨髓基质细胞，和血小板等4-8，这些细胞又与 AS 的发生有着复杂的联系。更有研究表明，骨髓来源的前体细胞能够生成血管细胞，在特定的情形下参与动脉壁修复、重建和损伤的形成9-11。骨髓源性的血管祖细胞（如平滑肌祖细胞）参与了 AS5华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 的
20、发生，并且本实验室余俊12等人已成功利用 Psm220a-EGFP-1 质粒重组体从小鼠间充质干细胞中分选出了平滑肌祖细胞，本实验利用 AS 的危险因子 LPS 作用于平滑肌祖细胞，观察不同浓度的 LPS 作用后，不同时间的 CXCR4 的表达情况，探讨 LPS 是否通过上调 SPC 的 CXCR4 表达至其归巢至损伤动脉，参与动脉粥样硬化的形成。实验材料与设备 一、 主要实验仪器1. PTC-200 型 PCR 扩增仪2. YJ- 1450 型超净工作台3. HMIAS-2000 图文分析系统4. HYA 恒温摇床5. ISO 9001 型电子天平6.高速冷冻离心机7.隔水式电热恒温培养箱8
21、.小型三用水箱9.电泳仪10.FS- 312 紫外透射反射检测分析仪11.1810B 型自动双重蒸馏水器12.KWY450 型电热干燥箱13.不锈钢断水自控电热蒸馏水器14.立式压力蒸气灭菌器15.电热手提式压力蒸气消毒器16.SK- 1 快速混匀漩涡器17.TGL- 16 台式高速离心机18.TDL- 5A 低速大容量离心机19.HF- 90 二氧化碳培养箱20.倒置相差显微镜6美国 Sigma 公司苏州净化设备厂千屏影像公司中国科学院武汉科学仪器厂上海精科天平仪器厂美国 Sigma 公司上海跃进医疗器械厂北京医疗设备厂BIO- RAD 公司上海复生生物工程研究所上海玻璃仪器一厂武汉市武昌实
22、验仪器厂上海博迅实业有限公司医疗设备厂上海博迅实业有限公司医疗设备厂贵州省开阳医疗器械厂国华仪器厂上海医用分析仪器厂上海悦丰仪器有限公司力康发展有限公司日本 Olympus 公司华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 二、主要材料与试剂1.小鼠骨髓源性平滑肌祖细胞2.细胞培养试剂谷氨酰胺（G）胎牛血清（FBS）DMEM 培养基胰酶本实验室Gibco 公司Gibco 公司Gibco 公司Gibco 公司3.脂多糖 Sigma 公司4.常规分子生物学试剂Trizol逆转录试剂盒引物合成PCR 试剂盒Marker 300bpMarker 200KDBCA 蛋白定量试剂盒Toyobo 公司To
23、yobo 公司Invitrogen 公司Trans 公司Trans 公司Houbio 公司Houbio 公司ECL 发光试剂盒 Houbio 公司3. 免疫学试剂兔抗小鼠 CXCR4 一抗【 fusin(H-118):SC-9046 一抗】Santa Cruz 公司Cy3 羊抗兔 IgG 二抗辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗TritonX-100Hochest33258Molecular Probes 公司博士德公司Gibco 公司博士德公司4. 其它化学试剂无水乙醇，丙酮，异丙醇，氯仿，甲醇，冰乙酸，Tris-碱，甘氨酸，过硫酸胺，十二烷基硫酸钠等均为国产分析纯。三、主要试剂的配制7华 中 科 技
24、 大 学 硕 士 学 位 论 文 1细胞培养及免疫组织化学试剂（1）DMEM 低糖型培养基（PH=7.4）DMEM 袋装培养粉 13.4g 先溶解于 300mL 三蒸水中，再加入 700mL 三蒸水使其充分溶解；高压灭菌的滤器过滤两次，无菌分装，置于-20保存备用；培养基临用前再加入胎牛血清、谷氨酰胺和 5.6%NaHCO3 溶液将 PH 调至 7.4 左右；取培养基 1mL 进行无菌试验，在确保无污染后用于细胞实验。（2）含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基（PH=7.2-7.4）10%胎牛血清1.5%谷氨酰胺5.6% NaHCO3DMEM 基础培养基10mL2mL86mL2mL配制完后，
25、取 1mL 培养基于 3恒温箱中进行无菌实验，确保无污染后用于细胞培养。（3）1.5% 谷氨酰胺（40mL）谷氨酰胺d3H2O0.6g40mL高压灭菌的滤器过滤灭菌 EP 分装，-20无菌保存。（4）001%胰蛋白酶胰蛋白酶1PBS 缓冲液10mg100mL4过夜，次日用高压灭菌的滤器过滤灭菌 EP 分装，-20无菌保存。（5）5.6%NaHCO3NaHCO3d 3 H2O 定容至 20mL2.8g无菌分装，高压 20 分钟后冷却，-20无菌保存。8华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 （6）0.2 mol/L NaH 2PO4NaH2PO4超纯水 定容至 500mL12g溶解后，高
26、压灭菌，室温保存。（7）0.2 mol/L Na2HPO4Na2HPO4.12 H2O 71.6g超纯水 定容至 溶解后，高压灭菌，室温保存。 （8）常规 PBS 缓冲液（ PH=7.4）NaClKClKH2PO4Na2HPO47H2O8.0g0.2g1.56g0.2g以上成分再加入 d 3 H2O 定容至 1000mL 无菌分装，高压 20 分钟后冷却，4无菌保存，使用前在常规 PBS 缓冲液中加入抗生素（青霉素：100U/mL，链霉素：100U/mL）。（9）免疫细胞化学专用 PBS 缓冲液（PH=7.4）A 液 NaH2PO4B 液 Na2HPO4A 液B 液NaCl7.8g+250mL
27、d 3 H2O17.9g+250mLd 3 H2O2.5mL22.5mL4.5g以上成分再加入 d 3 H2O 定容至 500mL 无菌分装，高压 20 分钟后冷却，4无菌保存。（10）0.1%TrionTrion 原液1PBS 缓冲液室温保存。90.1mL100mL华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 Western blot 试剂（1） 30%Acr/Bic 丙烯酰胺（Acr）甲叉双丙烯酰胺（Bic）超纯水37.5g1g定容至 100mL37下溶解，4保存，使用时再恢复至室温。（ 2）苯甲磺酰氟（ PMSF）贮存液（ 10 mg/mL）PMSF异丙醇混匀后贮存于 20 。（
28、3） 10%十二烷基硫酸钠SDS超纯水调节 PH 至 7.2，室温保存。（ 4） 10%过硫酸胺（ APS）过硫酸胺超纯水混匀后贮存于 保存。（ 5） 1.5mol/L 的 Tris-HCl（ pH 8.8）Tris-Base超纯水100mg10mL10g定容至 100mL1g10mL45.43 g2 00mL溶解后以浓盐酸调节 P H 值至 8.8，加超纯水定容至 250mL，高温灭菌后室温下保存。（ 6） 0.5mol/L 的 Tris-HCl（ pH 6.8）Tris-Base超纯水15.14g200mL溶解后以浓盐酸调节 P H 值至 6.8，加超纯水定容至 250mL，高温灭菌后室温
29、下保存。（7）单去污裂解液（50mmol/l Tris.HCl PH=8.0，150mmol/l NaCl，1%Triton-X100，10华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 100g/mL PMSF）：1mol/L Tris.HCl（PH=8.0）NaClTriton-X100蒸馏水2.5 mL0.438g0.5 mL定容至 50mL混匀后，4OC 保存。使用时，加入 PMSF 终浓度为 100g/mL（0.87 mL 裂解液加入 1.74mg/mLPMSF 50l）。（ 8） 12%分离胶（ 12% Separating Gel）：30%Acr/BicTris-SDS （ pH
30、 8.8）10%APSTEMED终体积为 4mL。（ 9） 4%积层胶（ 4% Stacking Gel）：1.6 mL2.4 mL20 L4.0 L30%Acr/BicTris-SDS （ pH 6.8）10% SDS10%APSTEMED终体积为 3mL。（ 10） 5Tris-甘氨酸电泳缓冲液：0.62.40.1202.4mLmLmLLLTris-base甘氨酸10% SDS加三蒸水至 500mL，4保存。（ 11）转膜缓冲液（ Transfer Buffer pH 9.3）：117.55g47g25mL华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Tris-base甘氨酸10% SD
31、S甲醇（Methanol ）加超纯水至 1000mL，4保存。（ 12） 1TBS：Tris-碱（Tris-Base）氯化钠（NaCl）5.82g2.93g3.75mL200mL3g8g超纯水溶解至 1000mL，pH 调至 7.4，4保存。（ 13） 1TBS-T：每 500mL 1TBS 加 Tween 20 1.25mL， 4 保存。（14）20%Tween20Tween20超纯水混匀后，4保存。（ 15）封闭液（含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液）脱脂奶粉（国产，伊利）TBST20mL定容至 100mL5g100 mL溶解后 4保存。使用时，恢复至室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用
32、。3. RT-PCR 相关检测试剂（1）10TAE 缓冲液Tris-碱冰乙酸0.5mol/L EDTA (PH=8.0)以上成分再加入 d 3 H2O 定容至 500mL 无菌分装。（2）2% 琼脂糖凝胶琼脂糖粉1248.4g11.4g20mL0.4g华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1TAE 20mL在锥形瓶中混匀后置于微波炉中加热，至琼脂糖粉完全溶解后室温下冷却至50-60 ，加入 Gold will 1ul 混匀。到入电泳槽中，赶走气泡并插上梳子，完全冷却后即可上样。（3） PCR 引物的配制：上下游引物粉末，各加入去离子三蒸水 40l，混匀，吸取上下游引物各 1l，加入
33、10l 三蒸水，混匀后即可用于 PCR。（ 4） 0.5mol/L EDTA(100mL)EDTA1PBS 缓冲液5.6%NaHCO3 将 PH 调至 8.0。（5）0.1%DEPC.H2O(1000mL)DEPCd 3 H2O避光，室温过夜。（6）75% 乙醇95%乙醇d 3 H2O（7）3% H2O230% H2O2d 3 H2O实验方法 一 细胞培养1. 平滑肌祖细胞的复苏（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出冷冻管；130.0186g100mL1mL定容至 1000mL75mL20mL1mL10mL华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 （2）迅速放入 38水浴中，并不时摇动，在
34、 1 分钟内使其完全融化，然后在无菌条件下取出细胞；（3）在 1000r/min 速度下离心 510 分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度 1109/L，置 37温箱静置培养；（4）次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况，若细胞密度较高，及时传代。2. 平滑肌祖细胞传代培养（1）人无菌室之前用肥皂洗手，用 75酒精擦拭消毒双手；（2）倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置 37下预温；（3）用 0.1新洁尔灭溶液将超净台擦净；（4）打开超净台的紫外灯照射台面 20 min 左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧
35、；（5）点燃酒精灯，取出无菌试管，吸管和刻度吸管，安上橡皮头，过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内；（6） 将培养用液瓶口用 75酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上；（7） 倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用 2 3 mL PBS 液洗去残留的旧培养基；（8） 每个大培养瓶加入 1 mL 0.1%胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶弃去；（9）加入少量含有 10优级胎牛血清 DMEM 培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(710 mL大瓶，35 mL小瓶)制成细
36、胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于 CO2 气体的进入，将培养瓶放回 CO2 培养箱。二 实验分组 待细胞生长到约 80融合的时候用于实验，在实验前 24h 将所有培养瓶中的培养基换成无血清 DMEM 培养基使细胞处于静止状态。14华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 将平滑肌祖细胞随机分为6组，收细胞爬片前放入一张盖玻片。正常对照组：低剂量组(L 组)：无血清DMEM培养基， 孵育0h；LPS终浓度为1ugmL， 孵育6h；中剂量组(M组)： LPS终浓度为10ugmL，孵育6 h； 高剂量组 (H组 )：12 h组：24 h组：LPS终浓度为30u
37、gmL，孵育 6 h；LPS终浓度为10ugmL，孵育 12 h；LPS终浓度为10ugmL，孵育 24 h。三 免疫荧光染色和共聚焦激光扫描显微镜分析检测各组细胞 CXCR4 蛋白表达收取各组平滑肌祖细胞的爬片 （1）将各组细胞培养瓶中培养基弃去；（2）用 37PBS 液润洗三遍；（3）将爬片用小无齿镊捞出放到玻璃平皿中，并加入 4丙酮固定 5 分钟；（4）再将爬片从丙酮溶液中捞出，双面胶固定至载玻片上；（5）倒置显微镜下观察细胞形态，-20保存备用。 免疫荧光染色 （1）-20 中取出各组细胞爬片；（2）置于配有 0.05%的 Triton-X 中室温破膜 6-10min；（3）用中性 P
38、BS 液冲洗 3 遍，每遍约 5-10min；（4）用滤纸吸干爬片周围水分，并轻按一下爬片使细胞表面干燥，立即加入 5%BSA封闭 20min；（5）37孵育 10-20min 阻断非特异性抗原；（6）直接甩去封闭液，加入稀释后的兔抗小鼠 CXCR4 一抗，每片约 30-50ul；（阴性对照组用 PBS 代替一抗做对照）（7）置于湿盒中，4冰箱孵育过夜；（8）次日取出湿盒放入 37恒温箱中回温 20min；（9）中性 PBS 液洗涤 3 遍，每遍 5-10min；15华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 （10）用滤纸吸干爬片周围水分，并轻按一下爬片使细胞表面干燥；（11）加入稀释后
39、的 Cy3 羊抗兔 IgG 二抗，避光， 37过夜；（12）次日取出在暗室用 PBS 洗涤 3 遍，每遍 5min；（13）用 Hochest33258 染核 10min，再用 PBS 液洗脱；（14）用饭盒避光置于共聚焦激光扫描显微镜下观察分析并照相。四 蛋白免疫印迹(Western Blot)检测 CXCR4 蛋白的表达收取各组平滑肌祖细胞的蛋白（按细胞蛋白抽提试剂说明书抽提细胞总蛋白）（1）培养瓶中各组细胞经的 PBS 液润洗后，加入动物细胞蛋白提取液 100ul；（2）将培养瓶置于冰袋上，用细胞刮子按一个方向尽可能的将细胞刮落；（3）倒置显微镜观察，镜下显示无贴壁细胞时可转移到 EP
40、管中；（4）低温高速离心机中以 4,12000rpm，离心 5min，用中枪以 32ul 每管转移至离心管中放于-80 保存备用。按下列操作步骤进行 Western blot，检测 CXCR4 的表达，HMIAS-2000 图文分析系统进行图象扫描与分析。（1）制胶：按照上述主要试剂的配制中配好 12%分离凝胶，混匀后在两面板的间隙中先快后慢灌注并放置于室温下。再用去离子水灌注分离凝胶顶部以隔绝空气，待分离胶完全凝固后，弃去上部的去离子水并用纸巾边缘吸净残留液体；同样按照上述主要试剂的配制中配好 4%积层胶，混匀后立即在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，再插上梳子，不要留空隙，将凝胶垂直放置于室
41、温下。待积层胶聚合完全后小心拔出梳子。（2） SDS-PAGE 电泳 待积层胶凝固后，拔出梳子，电泳槽内加入 1Tris-甘氨酸电泳缓冲液，恒压50V 预电泳 30min 以除去胶上的杂质提高电泳效率； -80 取出各组细胞蛋白溶液，按 4:1 的比例加入 5SDS 凝胶加样缓冲液，将蛋白样品 100煮沸 5min，使蛋白变性，立即冰浴；16华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 上样：第一泳道点 5ul Marker，用微量移液器按预定顺序加样，每孔上样 20ul蛋白。并在所有不用的泳道中加入等体积的 1SDS 凝胶加样缓冲液；电泳：先恒流 25mA 电泳约 30min 待样品浓缩到
42、上下部胶之间形成一条线时即可换成恒压 100V 电泳约 60min，待 Marker 跑出清楚的 7 条带即可停止电泳。（3）Western 电转移用蒸馏水洗涤转膜夹，然后用纱布擦干，戴上手套，切 6 张 3mm 滤纸和 1 张硝酸纤维素滤膜，其大小和凝胶大小完全吻合，并用软铅笔在滤纸一角做好标记；把醋酸纤维素滤膜漂浮于去离子水的表面湿润后浸泡于水中；在一浅托盘中加入少量转移缓冲液并把 6 张 3mm 滤纸浸泡其中；戴上手套按下列方法安装转移装置：a、依次在转膜夹的黑白面各垫一层海绵；b、再分别放置 3 张用转移缓冲液浸泡过的 3mm 滤纸，逐张叠放，精确对齐，然后用一玻璃移液管做滚筒以排挤出
43、所有气泡；c、根据黑胶白膜依次把硝酸纤维素滤膜和凝胶放在 3mm 滤纸上，准确对齐，而且在 3mm 滤纸与硝酸纤维素膜和凝胶之间尽量不留气泡；夹好转膜夹，连接电源，恒流 250mA 冰浴转膜 1h-1.5h；断开电流，取出硝酸纤维素膜，漂浮于去离子水中浸泡 5 分钟之后把滤膜转到丽春红染料中。（10丽春红染液：丽春红 S 2g，三氯醋酸 30g ,磺基水扬酸 30g，加入至 100mL），待蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，其换水数次。用防水墨笔标记出分子量标准的参照蛋白位置。（4） 封闭硝酸纤维素滤膜的免疫球蛋白结合位点：把硝酸纤维素滤膜放入平皿中，加入封闭液（ 5%脱脂奶粉
44、配 1TBS），室温平缓摇动 2 小时。（5） 第一抗体和靶蛋白的结合：弃去封闭液，将滤膜置于塑料袋中，立即加入 CXCR4（一抗（兔抗小鼠）1：300加入到封闭液中）与滤膜一同 4温育过夜；次日剪开塑料袋，废弃封闭液和抗体，并用 TBS-T 漂洗滤膜 3 次，每次 10 分钟。17华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 （6） 用辣根过氧化酶标记兔抗羊二抗与硝酸纤维素滤膜温育：弃去 TBS- T 后，在塑料袋中按 1：3000 加入辣根过氧化酶标记兔抗羊二抗，室温培育 1h，之后再用 TBS-T 漂洗滤膜 3 次。（7） 化学发光与曝光：将 ECL 发光试剂盒中的两种试剂按 1：1
45、混匀后在暗室里与硝酸纤维素膜孵育1 分钟；用滤纸吸尽膜上的液体，用保鲜膜包好后使含有蛋白的一面朝上，用感光胶片在压片盒中曝光 10 秒3 分钟；曝光后的感光胶片在显影液中显影 2 分钟，定影液中定影 2 分钟，水冲洗后晾干；根据暴光情况调整曝光时间，重复压片、显影及定影，选择满意的胶片。（8）结果分析应用 HMIAS-2000 图文分析系统进行图象扫描及半定量分析 Western blot 条带密度。五 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测 CXCR4 的 mRNA细胞总 RNA 的提取：（1）将各组培养瓶中培养基弃去；（2）PBS 液冲洗三遍；（3）加入 1mL Trizol 吹打细胞；（
46、4）倒置显微镜观察，看到细胞形态由长梭形变为小圆形即转移到 EP 管中置于-80保存备用；（5）从-80 取出各组 TRIZOL 混悬的细胞并于冰上自然溶解，分别加入 200ul 氯仿，盖好盖后剧烈振荡 15 秒，室温放置 23 分钟，然后 4离心，12000rpm ，20 分钟；（6）汲取上清液，转入另一 EP 管中并记录其体积，加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀后置于-20 过夜，使 RNA 能够尽可能多的沉淀下来；（7）次日取出静置的 EP 管 4离心，12000rpm ，20 分钟，并弃去上清液,加入 1mLDEPC18华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 水处理过的 75%乙醇,
47、混匀, 4离心，7500rpm，5 分钟；（8）再弃去上清液，置于超净台风干乙醇，加入 10ulDEPC 水溶解 RNA 沉淀，待完全溶解后可用枪头吹打并置于 55水浴 5 分钟。逆转录反应合成 cDNA体系：分为 A 体系和 B 体系A(10L)体系： 5 BufferDTT(0.1mm)dNTP(10mm)Obligo(dT20)(200g/L)Rnasin(40u/L)Reverse TrgAce(100u/L)DEPC 水4L2L1L1L0.5L0.2L1.3LB(10L)体系： 8L 左右 RNA 样品，其余用 DEPC 水补齐将以上 A 体系加入 B 体系混匀后，放入 PCR 仪，
48、设置为 4 40 分钟进行逆转录再 95 分钟即得到 cDNA 产物。产物放于-2保存备用。 PCR 扩增 CXCR4 基因:a、引物序列（ GAPDH 为内参）见表 1表 1 引物序列（GAPDH 为内参）基因名称 引物序列 产物 退火 循环数大小 温度CXCR4 上游 5，-ACG GCT GTA GAG CGA GTG TTG - 109bp 50 333，下游 5，-GGG TTC CTT GTT GGA GTC ATA G-3，GAPDH 上游 5， -AAC TTT GGC ATT GTG GAA GG-3， 231bp 50 33下游 5，-ACA CAT TGG GGG TAG GAA CA- 3，19华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 b、PCR 扩增按以下体系及步骤操作：上游引物下游引物10bufferdNTP (10mmol/L)Taq EcDNA加 Td H2O 总体积1l1l2.5l2.5l0.2l2l25l反应条件为 9温育 5min， 95变性 40s， 50复性 30s， 72延伸 40s 共33 个循环，末次循环 72延伸 10min。 PCR 产物电泳检测取反应产物5l 加入1l 6上样缓冲液进行2.0% 琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1TBE，Gold will染色，电压100V，电泳30min后紫外
