1、广西医科大学硕士学位论文广西地区特发性无精症患者Y染色体AZF基因微缺失的研究姓名：何劲松申请学位级别：硕士专业：内分泌指导教师：梁季鸿20070501硕士研究生毕业论文 广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究本文主要中英文对照 ： （）：特发性无精子症无精子基因因子 （）： 序列标签位点 （）： 单精子卵泡内注射 （）： 产前遗传学诊断 （）：多聚酶链反应 （）： 唯支持细胞综合症独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成
2、果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切责任。论文作者签名：衍劲描日期：，彳弓保护知识产权说明本人完全了解广西医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间，博士后工作人员、人才小高地工作人员在校工作期间，论文工作的知识产权单位属广西医科大学。本人保证在校期间和离校后，发表或使用论文工作成果时署名第一作者单位均为广西医科大学。学校有权保留论文，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。论文作
3、者签名：伫彩日期：沙以多，硕士研究生毕业论文 广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究摘 要目的 探讨广西地区特发性无精子症与染色体基因微缺失之间的关系，为本地区开展染色体微缺失的临床检测提供理论依据并建立一套可行的检测方法。材料和方法 选取染色体基因（）、（ ）、（）个区域共个特异性序列标签位点（ ），应用多重聚合酶链反应（ ）法，对例广西地区特发性无精子症患者和例正常已育男性的染色体基因进行微缺失检测。结果 例特发性无精症患者中有例缺失，缺失率为（），例正常男性均未检测出基因微缺失，两者的缺失率比较有统计学意义（；其中片段单独缺失例，缺失
4、率（），片段单独缺失例，缺失率（），和联合缺失例，缺失率（）。在有缺失的例患者中基因缺失的构成比为（）。本研究未检测出缺失。结论 基因的微缺失是导致广西地区特发性无精子症的重要原因，其中片段为缺失的热点；采用多重技术对原因不明的无精症患者染色体进行微缺失的检测分析是一种可行的方法。关键词：染色体微缺失；无精子症；无精子症基因； 多聚酶链反应：广西硕士研究生毕业论文 广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究 ： ： （）， （） “ ）、（ ） （ ） ： （ ） ，（） ，（ ） （） ： （） ： ；（）；硕士研究生毕业论文前广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究言不育症是临床
5、上常见的疾病，据近年欧美国家的统计，目前全世界已婚孕龄夫妇存在生育困难的发病率高达，其中病因在男方的称为不育症，约占。自世纪年代，男性不育的研究开始受到重视，临床医生也越来越注意不育夫妇中男性不育的因素。引起男性不育的常见原因有生殖道炎症、内分泌激素紊乱、精索静脉曲张、输精管梗阻、隐睾、免疫异常、染色体核型异常和性功能障碍，但仍有许多不育症找不到真正的原因，估计由遗传缺陷包括基因突变和染色体异常所引起的精子发生障碍导致的男性不育约占不育症的 【 】 。随着细胞遗传学和分子生物学等领域的深入研究，对男性不育的研究已经深入到分子水平，逐步认识到引起无精子症的基因位于染色体长臂远端 ，这一区域微缺失
6、和大多数特发性无精子症密切相关。年等 【 在对男性不育患者的染色体核型研究中发现，例无精子症患者的染色体长臂远端在显微镜下可见染色体断裂缺失现象，因此提出染色体长臂上存在着与精子发生相关的基因并将其命名为无精子因子（ ）。年染色体微缺失图发表，将染色体分为个区（），个亚区（）。随后在年甜等 【 】 将定位于染色体长臂远端第五、六区（、），并将其划分为、和三个区域。此外，有研究人员认为在和之间还存在一个区，但该区是否存在仍有争议 【 】 。 随后的研究发现在染色体上至少有个与精子发生相关的基因家族，其中部分基因被证明是精子发生所必需的，如、和基因等。随着辅助生殖技术的进步，特别是世纪年代后发展的
7、单精子卵泡内注射（ ）、睾丸精子穿刺或经皮穿刺附睾抽吸取精术，使越来越多的无精广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究及严重少精症患者有了生育的希望。但是技术可能将逃避自然选择的携带染色体异常、基因缺失或突变的精子注入胞浆内，从而将各种遗传缺陷传递给下一代。因此，欧美许多遗传学和生殖医学实验室都已经广泛开展染色体微缺失的分子检测的研究。年等在总结大量微缺失分子流行病学调查资料的基础上，提出了欧洲标准化的临床微缺失筛查方案，该方案用、代表基因，、代表基因，、代表基因对无精子症及重度少精子症进行筛查，进一步推动了区域微缺失检测的临床应用。近几年来我国的研究人员也开始重视染色体微缺失的分子检测
8、，为这一类人群提供筛查、遗传学咨询及诊断治疗。既往的研究表明基因的缺失率和缺失类型可能有种族和地域上的差异 【 。本研究通过多重技术以欧洲标准化的临床检测方案对广西地区名特发性无精子症患者进行染色体微缺失的检测，了解本地区基因的缺失率和缺失类型，为临床诊断提供指导。广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究材料和方法研究对象实验组 例已婚不育男性均来自广西医科大学第一附属医院男性科门诊年，年月就诊患者，均为广西地区常住人口，所有患者均为原发性不育（从未使配偶怀孕），年龄最小岁，最大岁，平均 岁，不育时间从 年不等，平均年；按世界卫生组织（）推荐的方法和诊断标准进行检查，所有患者均进行三次精
9、液检查，手淫取精，留取标本前禁欲天，每次间隔周以上，精液常规检查及离心找精子均未找到精子者为无精症组。上述患者行染色体核型分析、支原体、衣原体、内分泌激素（、）及阴囊的彩色超声检查，除外由染色体核型异常、内分泌激素紊乱、生殖道炎症、精索静脉曲张及隐睾等引起的男性不育的常见因素。对照组：阳性对照组例为已经生育的健康男性，年龄周岁，平均年龄 周岁，无生殖系统疾病。实验组和对照组间年龄比较差异无统计学意义（），两者有可比性。正常女性作为阴性对照。研究方法 的提取：抽取研究对象静脉血，用枸橼酸钠抗凝，放置。保存，备提取白细胞基因组用。抗凝血中加入等量明胶生理盐水，摇匀后 水浴静置分钟，沉淀红细胞，收集
10、上层液，离心分钟，弃上清，沉淀物富含有核细胞，加入（ 、 、 ）震荡溶解白细胞。加入 充分抽提使白细胞裂解。混匀后加入用饱和的苯酚，用吸管反复抽提混匀后离心分钟。转移上清液至另一管中，重复饱和酚抽提一次。将上清吸至另一管，加入硕士研究生毕业论文 广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究氯仿异戊醇混合液 ，用吸管反复抽提混匀后离心分钟。将上清液转移至另一管中。沿管壁缓慢加入倍体积的无水乙醇，轻摇使析出。吸取絮状的转移至 离心管中，用的乙醇洗涤两次，后加入液（啊、 、 ）充分溶解。用双光束紫外分光光度计测定的浓度和纯度。引物设计：查阅相关文献，选择染色体上个位点、和为目的基因，设计特异性引物
11、序列；选择位于染色体短臂（）上的睾丸决定因子（）基因和锌指蛋白基因（）为内对照，既存在于染色体短臂，也存在于染色体短臂（），其与起构成个目前推荐使用的参照基因。以上各基因的引物序列由上海透景生命科技有限公司合成。引物序列如下：一 一 ：一 一 一 ：一 一 一 ：一 一一 吗： 一 一 硕士研究生毕业论文 广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究 一 ： 一丌：一 ： 一 一 一 ：一 一（卜 一一 ：一 ：一 反应体系的建立和反应参数：见表表组分耐热聚合酶寡核苷酸引物基因检测反应体系组成终浓度条脱氧核苷三磷酸 种模板缓冲液其他成分与去离子水（） ， 缓冲液补足 体积所有的样品均经过次多
12、重完成，分别为和，每管中都包括、三个基因片段的特异性引物序列（）和对照基因引物，管中为、和，硕士研究生毕业论文 广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究管中为、和。反应的参数为： 预变性，反应， ，共个循环后，。延伸，反应产物置于。冰箱中保存。凡初筛发现有微缺失均进行再次扩增以确认。琼脂糖凝胶电泳的检测：取产物 ，置于琼脂糖凝胶上电泳，电泳电压，约完成，再于紫外线透射仪下检查和拍照。如图所示统计学处理：采用 统计学软件包，数据以； 表示，两两比较以卡方检验，差异有统计学意义。硕士研究生毕业论文结广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究果特发性无精症患者例检测出基因缺失，缺失率为（）
13、，例正常男性对照组无例检测出基因缺失，两者的缺失率比较，差异有统计学上意义（见表）。表两组间微缺失的比较采用四格表确切概率法，以单侧为有统计学意义；两组间差异有统计学意义。实验组的例基因缺失中单独缺失例，缺失率（），缺失例，缺失率（），和联合缺失例，缺失率（）。在有缺失的例患者的构成比中（、）基因缺失占（），明显高于其他各片段缺失类型。本研究未检测出（、）片段缺失（见表）。表各基因片段在微缺失中的构成比硕士研究生毕业论文 广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究图多重扩增产物电泳图：正常男性（阳性对照） ：基因缺失：基因缺失：正常女性（阴性对照） ：空白（蒸馏水） ：硕士研究生毕业论文讨
14、广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究论一、广西地区无精症与染色体基因缺失的关系男性特发性无精子症的遗传病因正日益受到重视，但由于生精过程的复杂性，长期以来对精子发生的病理生理认识不足，导致这部分患者在诊疗及愈后判断上的困难。尽管目前尚未证实某一特定基因与男性无精子症直接相关，但在染色体上已确定出部分的候选基因，如基因，基因及基因等。由于上述单个候选基因都不能单独解释无精子症的发生，因此，目前比较一致的看法是多基因共同参与精子发生的过程，其中一些重要的基因发生异常可能是导致无精子症发生的分子病理基础。大量的研究已证实染色体上基因的微缺失是导致生精障碍的重要原因，但各家报道的缺失率有很大
15、的差别，从不等 【 。有鉴于此，为明确广西地区男性特发性无精子症与染色体基因微缺失的关系并获得该地区这一群体基因微缺失的特点，本研究进行了基因微缺失的分子流行病学调查，结果发现：（）广西地区特发性无精子症患者区域微缺失率明显高于该地区的正常人群，两者缺失率在统计学上有意义，有力的证实了本地区男性特发性无精子症与染色体上区域微缺失密切相关。（）广西地区特发性无精子症患者基因微缺失率为（），与国内杨元等 报道的，丁显平等 报道成都地区的结果相近；与部分欧洲国家报道的，美州国家报道的，日本报道的等结果大体一致。但是最近部分欧洲中部国家报道微缺失率为蚶，不排除基因微缺失有地域和种族上的差异。另外在以唯
16、支持细胞综合症（ ）为筛查对象的研究中，微缺失率高达 】 ，因此，研究对象的选择、标记的密度和位置都可能对结果产生影响。（）本研究检测出例基因缺失，其中（、）片段单独缺失例，联合缺失硕士研究生毕业论文 广西地区特发性无精症学者染色体基因微缺失的研究例，在有缺失患者中的构成比为（），远高于其他片段的发生，说明为缺失热点，而、位点位于与生精过程相关的重要候选基因内，正是缺失位点形成的结构基础，该结论与等【对名男性不育患者基因微缺失筛查结果的分析大体一致：他们发现无精子症男性的缺失率最高，在有缺失的患者中又以区域最多。本研究中未检测出基因缺失，可能的原因是基因缺失率比较低，而我们的样本量较少。二、影
17、响基因微缺失检出率的因素正如前所述：各不同研究报道的基因微缺失率有很大的差别，从不等，之所以缺失频率范围变化如此大，除了地域和种族上的差异外，还可能有以下几点原因：（）研究对象入选的标准不同，可能是无精子症、少精子症和不育症但精子计数正常以及这几种人群的不同组合。无精和少精只是一个症状，本身就代表不同病因的不均一性。另外研究对象是否合并有其他可能导致无精子症的因素如染色体核型异常和内分泌激素紊乱等也可以影响检出率。等 【 总结年发表的篇文献表明缺失平均发生率为，其中比较高者均为原因不明性不育症患者。本研究的实验组例患者均为特发性无精子症，行检查前已排除染色体核型异常、内分泌激素紊乱、生殖道炎症
18、、精索静脉曲张和隐睾等可能导致无精子症的病因，检测结果是可信的。（）选取标记位置的密度及位置不同，不同的研究者进行染色体缺失分析时选用的数目有很大的差异，从个不等，检测时应用多少个染色体特异性序列标签位点（）及其代表性在国际上尚存争议，缺乏统一的标准。 等 【 】 认为选用、 、可以检测出以上的染色体微缺失。国内杨元等 【 认为利用三个亚区的缺失位点，微缺失的检出率高达，基本能满足临床检测的要求。硕士研究生毕业论文 广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究另外 等 【 】 的研究表明：染色体基因微缺失在无精子症患者中的检出率与选择多少个位点无关，主要的影响因素是要选择那些已知的在男性不育
19、患者特异缺失的非多态性位点，同时位于功能候选基因的序列内。本研究即利用上述个位点进行检测，其中、位于区的功能候选基因内，、位于区的功能候选基因内，、位于区的功能候选基因内，检测的结果与国内外众多的大体一致，提示可以利用本研究的方法对广西地区人群无精子症患者基因微缺失进行检测。三、基因微缺失检测的临床意义近年来男性不育患者的就诊率不断升高和辅助生殖技术规模的不断扩大，开展无精子症基因的检测在临床工作中显得越来越重要。尽管带有染色体微缺失的精子其受精率与正常的精子相比有否差别存在一些矛盾的结果 【 ，但对这些病人可能存在的遗传学问题的解决是至关重要的。所以对这一群体的遗传学咨询及筛查是十分必要的：
20、（）无精子和少精子存在的遗传学问题如染色体微缺失可垂直遗传给男性后代，可通过术前筛查进行种植前遗传学诊断（ ）切断遗传途径，一种方法是选女胚移植，另一种方法是对生殖细胞嵌合体的男性也可以选择正常男胚移植。（）诊断染色体微缺失，找到精子生成障碍的真正原因从而避免不必要的药物及手术治疗。（）明确无精子症患者染色体微缺失的类型，现研究表明口 】【 】【 】 ，缺失者的病理表现为细胞综合征（）型（即只有支持细胞而无精原细胞出现），另有少部分表现为精子生成受抑而表现为严重少精子症；基因全部缺失常与生精阻滞有关，病理通常表现为精子发生停留在精母细胞或精子细胞阶段，基因部分缺失或同时伴有或缺失时，患者的临床
21、表现成多样化 【 】 ，包括唯支持细胞综合征、无精子症或少精子症。基因缺硕士研究生毕业论文 广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究失者精子计数可以从无到正常但伴有精子形态异常，睾丸活检的病理表现为与型唯支持细胞综合征（ ）相关，即有精原细胞呈现并有有限的精子生成或精子生成减少，其中有可活检到成熟精子，故对睾丸活检能否发现成熟精子有一定的指导意义。（）由于缺失可能出现随时间进行性精子数量减少的现象】，所以携带缺失的少精症或无精症的父亲如能通过技术受孕，其男性后代在成年早期也应考虑精液的保存，避免将来不必要的治疗。尽管父亲可将这种染色体微缺失遗传给儿子，但后代的遗传表型可能有所不同，还不能
22、完全预测其不育的程度。本研究中所有患者均因不育而多方就诊，行常规染色体核型分析、支原体、衣原体、内分泌激素及阴囊的彩色超声检查未发现异常，行基因检测后能找到部分患者的不育原因，减少不必要的检查和治疗。另有部分患者欲行术，基因检测能大致预测睾丸是否能产生成熟的精子，若有缺失时告之其可能存在的遗传风险。随着研究的不断深入，基因的研究可能会向以下几个发展方向：（）进一步明确基因型与表型的关系，为临床的诊断和治疗提供依据。（）对基因缺失是否存在地域及种族差异进行深入的研究。（）前的研究集中在微缺失特征及基因的发现，对染色体基因编码的蛋白质知之甚少，而其重要的部分可能涉及到代谢和加工的过程，这是生殖细胞分化的一个重要方面。（）规范和统一临床检测的标准，为诊断和治疗提供依据。硕士研究生毕业论文结广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究论染色体基因微缺失是导致广西地区特发性无精子症的重要原因；其中基因片段为缺失热点。采用多重技术对原因不明的无精症患者染色体进行检测分析是一种可行的方法。硕士研究生毕业论文 广西地区特发性无精症患者染色体基因微缺失的研究参考文献王一飞主编生殖医学 人类的生育、不育与节育人民卫生出版 ， ， ，（）： ， ，（）： ， ： ，（）： ， ， ，（）： ， ， 锣 ， ， （）： ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ，（）： ， ，
