1、 蔗糖酯磷脂脂质体对家兔腹腔巨噬细胞膜磷脂含量的影响作者：陈淑芬，钱士匀，姚震，伍强【摘要】 目的：观察蔗糖酯与磷脂组成的脂质体对巨噬细胞膜磷脂含量变化的影响。方法：按不同比例将乙酸异丁酸蔗糖酯与卵磷脂、鞘磷脂和胆固醇混合，溶于乙醚中，然后注入 pH 7.2 的PBS 缓冲液中，制成卵磷脂脂质体及蔗糖酯卵磷脂脂质体。用肝素沉淀法分离血浆中的 LDL，再用铜诱导法进行氧化修饰。将分离纯化的家兔腹腔巨噬细胞与 OxLDL 共同孵育 24 h 后，加入六种脂质体，继续孵育 1224 h；此外，在 OxLDL 与巨噬细胞孵育的同时加入脂质体，共同培养 2436 h，结束实验，用钼蓝比色法检测细胞膜磷脂
2、。结果：刚纯化的家兔腹腔巨噬细胞的膜磷脂含量平均为(0.4290.084) mg/百万个细胞，经与 OxLDL 共同孵育 24 h后，其细胞膜磷脂含量增加到(0.7170.045)mg/百万个细胞(student t =10.911 9，P0.01)。在巨噬细胞从 OxLDL 中充分摄取了胆固醇后，加入六种脂质体作用 12、24 h 后，各组细胞的膜磷脂均低于荷脂细胞(或泡沫细胞)的膜磷脂含量(F 值分别为 2.925 2、7.1 916,P0.05)，而与刚纯化的巨噬细胞膜磷脂含量差异无统计学意义(F 值分别为 0.344 4、0.2 000,P0.05)；巨噬细胞与各种脂质体及 OxLDL
3、 共同孵育 2436 h 后，经两种卵磷脂脂质体作用过的细胞的膜磷脂含量高于经四种蔗糖酯卵磷脂脂质体作用过的细胞，其中含鞘磷脂的磷脂脂质体(EPCI)作用过的细胞，膜磷脂含量虽高于四种蔗糖酯脂质体作用过的细胞，但差异无统计学意义(P0.05)，而不含鞘磷脂的磷脂脂质体 (EPCII)作用过的细胞，膜磷脂含量不仅明显高于四种蔗糖酯脂质体作用过的细胞(P0.05)，而且明显高于荷脂的或泡沫化的巨噬细胞(t 值分别为 3.7 629、3.2 399，P0.01)。结论：巨噬细胞从 OxLDL 中摄取胆固醇的同时，OxLDL 中的氧化磷脂可能通过弥散作用，使细胞膜的磷脂含量增高；加入脂质体后，可能因细
4、胞膜与脂质体之间出现了氧化磷脂的浓度梯度，促使氧化磷脂向脂质体弥散，从而使细胞膜磷脂的含量降低。在脂质体与巨噬细胞及 OxLDL 共存的情况下，膜材与细胞膜组分相近的卵磷脂脂质体，可能通过融合或/和吞噬等方式使细胞的膜磷脂含量增加；蔗糖酯脂质体可能由于结构差异而不能与细胞膜之间进行类似的磷脂转移。 【关键词】 蔗糖酯；磷脂；脂质体；膜磷脂含量；肝素沉淀法ABSTRACTObjective: To observe the effects of the liposome composed by sucrose ester and phospholipids on the membrane phos
5、phatide content of rabbit peritoneal macrophages. Methods: Lecithin and the sucrose esterphospholipids liposome were prepared using the ethyl ether injection method by mixing sucrose ester with lecithin, sphingomyelin and cholesterol according to different lipids ratio. Plasma LDL was separated by h
6、eparin precipitation and oxidatively modified by copper ions to form oxidized low density lipoprotein(OxLDL). The rabbit peritoneal macrophages were incubated with OxLDL for 24 hours following by adding six kinds of liposome to continue incubation from 12 to 24 hours，and then the membrane phosphatid
7、e content was detected by molybdenum blue colormetric method. In another case，the six kinds of liposome were added at the same time when the macrophages have being incubated with OxLDL from 24 to 36 hours，then membrane phosphatide content was detected. Results: The average membrane phosphatide conte
8、nt of macrophages purified from rabbit abdominal cavity was (0.429 0.084) mg/million cells, which was increased to (0.7170.045) mg/million cells after incubation with OxLDL for 24 hours (student t=10.9 119, P0.01). When various liposome were added and proceed to incubate for 12 to 24 hours after the
9、 cells had taken up cholesterol sufficiently from OxLDL, the phosphatide contents was decreased and was lower than that of lipidloaded or foam cells (F value is 2.9 252 , 7.1 916 respectively, P0.05). After the cells were incubated with OxLDL and various liposomes for 24 to 36 hours, the phosphatide
10、 contents of the cells treated with two kinds of lecithin liposome were higher than that of the cells treated with four kinds of macrophages. Specifically, the membrane phosphatide content of the EPCI treated group was not significant higher than that of other four groups treated by sucrose ester li
11、posome (P0.05), however, the EPCII treated group showed significant higher phosphatide contents compared with both the sucrose ester treated groups (P0.05) and the lipidloaded or foam cells (t value was 3.7629, 3.2399 respectively, P0.01). Conclusion: The Oxidized phospholipids in LDL might be trans
12、ferred into the membrane of macrophages via dispersion during the uptake OxLDL. The addition of liposome might result in a concentrative gradient of oxidized phospholipids between cell membrane and liposome, and prompt oxidized phospholipids to disperse into liposome and decrease the membrane phosph
13、olipids content. When liposome is incubated with macrophages and Ox LDL, the lecithin liposomes might cause the cell membrane phospholipids increased through membrane fuse and/or phagocytosis due to the similarity of their lipid component with the cell membrane, however, the sucrose ester liposomes
14、may not change phospholipids with the cell membrane because of the discrepancy of the molecular structure. KEY WORDS Sucrose ester; Phospholipids; Membrane phosphatide content; Heparin precipitation methods细胞膜是以磷脂双层为骨架的液态镶嵌结构，磷脂头部基团的极性1，及其脂肪酸尾链的长度及饱和度2，决定了膜的表面电位值及膜的理化性征。细胞的生命活动得以实现，有赖于生物膜体系的动态特征，即物质
15、的交换及自身的更新于重构，其中，细胞膜的磷脂的种类和含量变化是膜更新重构的重要方面。脂质体与细胞膜有相似的结构和组分，能够通过与细胞膜之间的脂交换或膜融合的方式，将其携带的脂质成分转移到细胞膜上，从而修饰或修补细胞膜的脂质成分，稳定细胞的结构和功能3。脂质体与细胞之间磷脂转移的方式与构建脂质体的膜材有重要关系，我们用蔗糖酯和卵磷脂构建的脂质体，对家兔巨噬细胞外流的影响的同时，也检测了在不同条件经脂质体作用后，细胞膜磷脂含量的变化情况，现报道如下。1 材料与方法1.1 仪器与试剂U2900 双光束紫外可见光分光光度计、WJ 280 型二氧化碳培养箱、H2050R1 型高速冷冻离心机、SHZB 型
16、恒温振荡水浴箱。乙酸异丁酸蔗糖酯(sucrose acetate isobutyrate)、鞘磷脂(sphingo myelin)及 Sephadex G 50 购于 Sigma 公司，蛋黄卵磷脂(phosphatidycholine egg yolk)为北京双旋微生物培养基厂产品，胆固醇为广东环凯微生物科技公司产品，肝素钠(heparin sodium)及小牛血清购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其余试剂均为分析纯。1.2 脂质体制备按不同的摩尔比将乙酸异丁酸蔗糖酯与细胞膜中两种主要的磷脂，即卵磷脂和鞘磷脂混合，再加入等摩尔比的胆固醇，用乙醚溶解后, 在 55 恒温水浴振荡的条件下，通过
17、细针头将其缓缓注入 pH 7.2的 PBS 缓冲液中，乙醚蒸发，脂质分子分散到基质液中并形成单层脂质体，根据不同脂质配比制成以下两类六种脂质体：(1)卵磷脂脂质体EPCP I卵磷脂胆固醇鞘磷脂=310.1 ；EPC P卵磷脂胆固醇=31。(2)蔗糖酯脂质体SAEPCPI ：蔗糖酯 卵磷脂胆固醇 鞘磷脂=331 0.1；SA EPCP：蔗糖酯卵磷脂胆固醇鞘磷脂=1.5 310.1；SA EPCPIII 蔗糖酯:卵磷脂: 胆固醇=331； SAEPCPIV蔗糖酯卵磷脂胆固醇=1.531 。脂质体制成后过入 Sephadex G 50 微型凝胶柱，除去残余乙醚，并使脂质体粒径均匀。1.3 LDL 的
18、分离和氧化修饰按 11 的比例混合新鲜血浆(购自海南省血液中心) 与 LDL 沉淀液(50 U/mL 肝素钠/柠檬酸钠缓冲液：pH 5.03)，室温下静置 10 min，3 000 rpm 离心 10 min，弃上清。用 pH 5.11 柠檬酸钠缓冲液洗涤沉淀后，再用 1 倍于原血浆体积的高盐磷酸缓冲液(含 NaCl 282 mmol/L)使 LDL 溶解，装入透析袋；pH7.4 PBS 4 透析 24 h。测定LDL 中的蛋白质浓度,并调整其浓度至 16 g/L。取制备好的 LDL 液，加入等体积的 10 nmol/L CuSO4 溶液，混匀，37 水浴加温 20 h。以磷酸缓冲液校零，每隔
19、一小时测 234 nm 处的光密度(OD) 值，当OD 值达高峰开始下降时加等体积的 0.2%EDTA 溶液终止反应。最后用 1 mmol/L 的 EDTA 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 4 透析 24 h。TBARS 法测定 LDL 的氧化前后的丙二醛(MDA) 含量分别为 0.87 mol/g 蛋白和 9.75 mol/g 蛋白。1.4 巨噬细胞的分离、纯化及摄取胆固醇给家兔腹腔注射 200 mL6%淀粉肉汤。34 d 以后处死动物，消毒腹部，沿腹中线注入预冷的含 10 U/mL 肝素和 10%小牛血清的PBS,轻轻按摩 5 min，然后剪开腹壁，吸出渗出液，再用同样容量的预冷 PBSH
20、 冲洗腹腔 23 次。合并渗出液于离心管中， 4 ，250g 离心 10 min，去上清液。用预冷的 RPMI1 640 培养液洗涤细胞 3 次后悬浮细胞。采用贴壁法分离纯化巨噬细胞，0.3%台盼蓝检测细胞活力后,用含 10%小牛血清的 RPMI1640 培养液将细胞浓度调至 3109 个/L 。1.5 脂质体干预实验将分离纯化的腹腔巨噬细胞与 OxLDL 共同孵育 24 h，使其充分摄取胆固醇而转化成荷脂细胞或泡沫细胞，再加入脂质体；另在OxLDL 与巨噬细胞共同孵育的同时即加入各种脂质体，于 5% CO2,37 环境中进行细胞培养。1.6 细胞膜磷脂检测用 Fovch 溶剂氯仿：甲醇=21
21、(V/V)抽提细胞膜中的磷脂，然后用浓硫酸和过氯酸的混合液消化抽提出来的磷脂，使其中的磷离子解离，最后用 0.25%钼酸铵显色液(临用前与 10% VitC 溶液按91 的比例混合)显色，6070 水浴 10 min，于 700 nm 处测吸光度，计算磷脂浓度。1.7 统计学处理 海南医学院学报 Vol.16 No.2 Feb.2010实验数据均以(s)表示，两样本均数间比较用 t 检验，多组间比较用方差分析，多组间均数的两两比较用 q 检验。2 结果2.1 蔗糖酯脂质体对家兔荷脂的或泡沫化的腹腔巨噬细胞膜磷脂含量的影响从家兔腹腔中收集、纯化的巨噬细胞，其细胞膜磷脂含量平均为(0.4290.0
22、84) mg/百万个细胞，经与 OxLDL 共同孵育 24 h 后，其细胞膜磷脂含量为(0.7170.045) mg/百万个细胞，较前明显增加(student t=10.9119，P0.01)。说明，巨噬细胞从 OxLDL 中摄取胆固醇的同时，OxLDL 中的磷脂也向细胞膜发生了转移。于巨噬细胞充分摄取了 OxLDL 后，加入六种脂质体作用 12、24 h 后，各组细胞的膜磷脂含量之间差异无统计学意义(F 值分别为 0.2 181和 2.2 543，P0.05)；但其膜磷脂含量均较荷脂细胞(或泡沫细胞)的膜磷脂含量为低，(F 值分别为 2.9 252、7.1 916,P0.05；各组细胞分别与
23、荷脂细胞(或泡沫细胞)比较，P 均0.05)，与纯化的巨噬细胞膜磷脂含量相比，差异无统计学意义(F 值分别为 0.3 444、0.2 000,P0.05)(表 1)。推测脂质体的作用，造成了膜磷脂的丢失或转移。2.2 蔗糖酯磷脂脂质体组分差异对膜磷脂含量变化的影响将各种脂质体和 OxLDL 同时与巨噬细胞孵育，则 2436 h 后，各组细胞的膜磷脂含量之间存在明显差异(F 值分别为 5.9 791 和5.126，P0.05)。主要表现为，经两种卵磷脂脂质体作用过的细胞的膜磷脂含量高于经四种蔗糖酯卵磷脂脂质体作用过的细胞，其中含鞘磷脂的磷脂脂质体(EPCI)作用过的细胞，膜磷脂含量虽高于四种蔗糖
24、酯脂质体作用过的细胞，但差异无统计学意义(24 h 后的q 值分别为 0.2 808、1.4 919、1.9 833、2.3 168；36 h 后的 q 值分别为 0.5 772、0.8 492、0.9 713、0.7 382，P0.05)，不含鞘磷脂的磷脂脂质体(EPCII)作用过的细胞，膜磷脂含量则明显高于四种蔗糖酯脂质体作用过的细胞(24 h 后的 q 值分别为 4.6 160、5.8 270、6.3 184、6.6 519；36 h 后的 q 值分别为 5.0 112、5.6 952、6.0 023、5.4 160，P0.05)。此外，经六种脂质体作用过的细胞，唯有不含鞘磷脂的卵磷脂脂
25、质体 EPCP 组巨噬细胞的膜磷脂含量，在孵育 24 h 及 36 h 后明显高于荷脂的或泡沫化的巨噬细胞(t 值分别为 3.7 629、 3.2 399， P0.01)，其余五组细胞的膜磷脂含量与荷脂或泡沫化的巨噬细胞相比，均差异无统计学意义(24 h 后，t 值分别为 0.4 588、0.2 448、0.6 782、1.0 527、1.3 069；36 h 后，t 值分别为 0.5 249、0.5 824、1.1 041、1.3 283、0.8 912；P0.05)(表 2)。推测，与膜组分相近的卵磷脂脂质体与巨噬细胞的细胞膜之间发生聊脂质融合，而且，脂质体的组分差异会影响膜融合的过程和结
26、果。蔗糖酯由于结构差异，不能与细胞膜之间进行膜融合。表 2 脂质体与 OxLDL 同时作用后家兔腹腔巨噬细胞的膜磷脂含量 (mg/百万个细胞)(略 )注:*巨噬细胞与 OxLDL 及 6 种脂质体共同孵育 24 h；*巨噬细胞与 OxLDL 及 6 种脂质体共同孵育 36 h。表 1 脂质体作用后家兔腹腔荷脂或泡沫化巨噬细胞的膜磷脂含量 (略) 注:* 巨噬细胞与 OxLDL 共同孵育 24 h，再与 6 种脂质体共同孵育 12 h；*巨噬细胞与 OxLDL 共同孵育 24 h，再与 6 种脂质体共同孵育 24 h。3 讨论LDL 被氧化修饰后，其携带的胆固醇通过清道夫受体被单核/巨噬细胞无反
27、馈抑制的摄取，是动脉粥样硬化疾病发生、发展的关键步骤4，在这个过程中，也存在磷脂成分在脂蛋白和巨噬细胞膜之间的转移。LDL 颗粒的核心是大量的胆固醇酯及少量的甘油三酯，外层有磷脂单分子层包绕，磷脂的脂肪酸尾链半数以上是多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)，恰好是自由基氧化攻击的主要目标5。巨噬细胞黏附好渗入动脉壁能促进脂质条纹的形成，脂质条纹演变的触发事件是 LDL 堆积、滞留并氧化成轻微氧化的 LDL (minimally oxidized LDL,MMLDL)6。MMLDL 中的活性产物包括磷脂的氧化产物：PGPC (1 palmitoyl
28、2glutaroyl snglycero 3 phosphocholine)、POVPC (1 palmitoyl2(5oxovaleroyl)snglycero3phosphocholine)和 PEIPC (1 palmitoyl2epoxyisoprostanesn glycero3phosphocholine)等。POVPC 和 PEIPC 可以激活血小板激活因子 (PAF)，PGPC 则可以诱导单核细胞及中性粒细胞黏附于内皮，因此对于动脉粥样硬化病变的发生有重要意义7。PGPC 和 POVPC 有着高度相似的结构：单个疏水链、大体积的极性头部和一个极性的 sn2 酰基片段。这样的结构
29、使其具有了高度的表面活性，从而能够快速地在细胞膜、和脂质体之间移动8。研究表明，这些氧化磷脂在膜间的转移是自发的，其机制就在于脂质单体的弥散9。我们的实验结果显示，家兔腹腔巨噬细胞在与 OxLDL 共同孵育 24 h 后，细胞膜的磷脂含量明显增高，加入各种脂质体处理 12，24 h 后，各组细胞的膜磷脂含量有所降低。推测其原因就在于，LDL 被氧化修饰后，所产生的氧化磷脂顺浓度梯度弥散到巨噬细胞膜中，使其膜磷脂含量增高；加入脂质体后，由于脂质体与细胞膜的结构相似，转移到细胞膜中的氧化磷脂又顺浓度梯度弥散到脂质体的双层膜中，从而使细胞膜中的磷脂含量降低。 脂质体是由磷脂等两亲性物质在水相溶液中自
30、组装形成的闭和层膜结构，与细胞膜有很强的亲和力，既可与细胞膜进行脂质交换，也能通过融合或吞噬等方式，使脂质体的膜组分成为细胞膜的一部分3。此外，脂质体与脂蛋白之间，尤其是高密度脂蛋白，发生制止交换3。但脂质体与 OxLDL 之间如何进行脂质交换，尤其是在与巨噬细胞共存的情况下，尚不十分明确。我们的实验结果显示，在三种磷脂膜系统共同孵育24，36 h 后，不同类型的脂质体处理的细胞的膜磷脂含量呈现出明显的差异，卵磷脂脂质体作用过的细胞，其膜磷脂含量要高于蔗糖酯卵磷脂脂质体作用过的细胞，尤以不含鞘磷脂的单纯卵磷脂脂质体作用过的细胞为著，而且该组细胞的膜磷脂含量还高于荷脂的或泡沫化的巨噬细胞。由于脂
31、质体与细胞膜融合的前提之一，是两者膜组分的相似，因此，我们推测卵磷脂脂质体因组分相似而与细胞膜之间发生了融合，从而使细胞膜的磷脂含量升高。由于影响两个层膜系统间相互作用的机制主要是静电力、范德华力及氢键力等弱相互作用，这些弱作用力的效果取决于膜组分的分子结构10。本次实验中，我们使用的蔗糖八酯是乙酸异丁酸蔗糖酯，其脂肪酸链很短，而细胞膜磷脂的脂肪酸链一般在 18 个碳原子左右，两者之间的这种结构差异，可能造成彼此之间的范德华力较弱；而且蔗糖酯头部的呋喃环上的八个羟基都被取代，形成氢键的几率降低；另外蔗糖酯的八个链长短不一，掺入磷脂之后，必然影响磷脂尾链排布和堆积，这种空间结构也将产生位阻效应11，从而在两个层膜系统间产生排斥效应，并进而影响脂质体与细胞膜之间的磷脂转移。【
