1、川西獐牙菜提取物上调 HepG2 细胞膜转运蛋白 MRP3、核转录因子 SP1 及核受体CPF、PXR 表达刘 畅，李绍雪，高 宇，柴 进， 张 全， 陈文生 （400038 重庆，第三军医大学西南医院全军消化病研究所摘要 目的 体外培养 HepG2 细胞观察川西獐牙菜(swertia mussitii)对多药耐药相关蛋白 3 (multidrug resistance protein 3,MRP3)、核转录因子 SP1（specificity protein 1 transcription factor ，SP1)及核受体孕烷 X 受体(pregnane X receptor，PXR )、C
2、yp7a 启动子结合因子(cyp7a promoter binding factor,CPF)表达的影响。方法 用 MTT 比色法检测川西獐牙菜的最佳作用浓度，再分别于 0、12、24、48、72h 刺激细胞，抽提细胞的 RNA、膜蛋白和核蛋白，采用荧光定量 PCR 和蛋白免疫印迹技术检测膜转运蛋白 MRP3、转录因子 SP1 及核受体 PXR、CPF 在转录与蛋白水平的表达变化。每个时间点设立阴性对照DMSO 组和阳性对照 UDCA 组。结果 MTT 比色法选取 50mol/L 作为工作浓度刺激细胞，与阴性对照组相比后发现：川西獐牙菜可显著诱导 HepG2 细胞膜转运蛋白 MRP3 的 mR
3、NA(24、48、72h 增高 0.68、1.46、2.10 倍， P0.05)和蛋白水平(24、48、72h 增高1.20、1.19、1.55 倍， P0.05)的高表达，其作用强于 UDCA。川西獐牙菜也可明显上调转录因子 SP1mRNA(24、48、72h 增高1.31、1.32、1.13 倍， P0.05)及蛋白 (24、48h 增高 0.66、0.52 倍， P0.05)的表达，UDCA 组 SP1 表达无明显变化。核受体PXR mRNA（24、48、72h 增高 0.99、2.12、2.13 倍， P0.05）和蛋白水平(24、48、72h 增高 0.40、0.53、0.52 倍，
4、 P0.05)表达增高，作用强于 UDCA。CPF 的 mRNA（72h 增高 0.7 倍， P0.05）及蛋白水平(48、72h 增高 0.96、0.90 倍， P0.05)上调作用效果略低于 UDCA 组。结论 川西獐牙菜可刺激 HepG2 细胞膜转运蛋白 MRP3 上调，且有可能是通过核转录因子 SP1 及核受体PXR、CPF 上调其表达。关键词 UDCA；川西獐牙菜；MRP3；SP1；CPF；PXR中图法分类号 文献标志码 ASwertia mussitii upregulates expression of membrane protein MRP3 、nuclear transcr
5、iption factor SP1 and nuclear receptors PXR and CPF in HepG2 cells Liu Chang, Li Shaoxue, Gao Yu, Chai Jin, Zhang Quan, Chen Wensheng(Institute of Gastroenterology of PLA, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China.)Abstract Objective To observe the impact of Swer
6、tia mussitii on the expression of multidrug resistance protein 3(MRP3),specificity Protein 1 transcription factor（ SP1) ，Pregnane X receptor(PXR)and Cyp7a promoter binding factor(CPF) in HepG2 cells in vitro. Methods The optimal concentration of Swertia mussitii used to stimulate HepG2 cells was det
7、ermined by MTT method. Then， Total RNA , membrane protein and nuclear protein were extracted from HepG2 Cells at 0h，12h，24h，48h and 72h post co-cultured with Swertia mussitii. The expression of MRP3，SP1，PXR and CPF at mRNA and protein level were detected using real-time quantitative PCR and Western
8、blotting，respectively. Results The expression of MRP3 was significantly induced by Swertia mussitii at mRNA(24、48、72h increase 0.68、1.46、2.10-fold， P0.05) and protein level(24、48、72h increase 1.20、1.19、1.55-fold， P0.05), which was more efficient than that by UDCA. The expression of transcription fac
9、tor SP1 at mRNA(24、48、72h increase 1.31、1.32、1.13-fold， P0.05) and protein level(24、48h increase 0.66、0.52-fold， P0.05) were elevated by Swertia mussitii.The nuclear receptor PXR at mRNA （24、48、72h increase 0.99、2.12、2.13-fold， P0.05）and protein level(24、48、 72h increase 0.40、0.53、0.52-fold， P0.05),
10、CPF at mRNA （72h increase 0.7-fold， P0.05）and protein level (48、72h increase 0.96、0.90-fold， P0.05)were also Comment h1: 是否改为：川西獐牙菜提取物？关于其化学结构是否已知？advanced by Swertia mussitii . The effect of Swertia mussitii was stronger than that of UDCA on the expression of PXR. Conclusion Swertia mussitii could
11、up-regulate the expression of MRP3 in HepG2 cells, this regulation may be related with PXR and CPF Key words UDCA;Swertia mussotii ;SP1;CPF;PXR;Supported by the National Natural Science Foundation of China(81100280). Corresponding author: Chen Wensheng，Tel ：86-23-68765183,E-mail:基金项目 国家自然科学基金 (81100
12、280)；重庆市科委自然基金重点项目（cstc2012jjB0079）；重庆市科委攻关课题（CSTC2010AB5068）通信作者 陈文生，电话:（023）68765183，E-mail:多药耐药相关蛋白 3 (multidrug resistance protein 3,MRP3)是有 ATP结合域的 MRP (ABCC)超家族中的一员,在人体的多种组织中表达，包括肾脏、膀胱、肠道、胰腺和肾上腺等，但在正常的肝脏组织中表达甚低 1-2。MRP3 位于肝细胞的基底外侧膜，是一种有机阴离子排泌泵，主要转运胆汁酸、胆红素、白三烯和一些抗癌药物 1-2。在肝脏出现胆汁淤积的情况下，MRP3 作为代偿
13、性保护反应显著增高，使胆汁酸由肝细胞内向血液中排泌，减少肝细胞内有毒胆汁酸聚集，从而起到保护肝脏的作用 2-4。但是，目前 MRP3的调控机制尚不明确。MRP3 的上调可能与核转录因子 SP1及核受体 PXR、CPF 表达增高有关 4-6。传统中药川西獐牙菜，主要分布于青海、西藏、云南和四川西部地区，是利胆退黄的特效药物，临床上用于治疗急慢性黄疸性肝炎等胆汁淤积性疾病。前期我们在胆汁淤积动物模型中发现，川西獐牙菜可显著减轻肝损伤，降低胆汁酸、总胆红素、碱性磷酸酶、门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶等指标。但是，其调节机制尚不明确。本研究运用 Weatern blot和荧光定量 PCR等实验技
14、术，观察川西獐牙菜对 HepG2细胞膜转运蛋白 MRP3表达情况，以及与其调控密切相关的 SP1、PXR、CPF 等表达的影响，探讨川西獐牙菜对胆汁淤积的临床治疗作用。1 材料与方法1.1 主要材料与仪器 人肝癌细胞 HepG2细胞(中科院上海细胞库)，胎牛血清(FBS)、1640 培养基(HyClone,美国)，川西獐牙菜(重庆市中药研究所)，MTT(碧云天生物科技研究所)，UDCA(Sigma，美国)，Trizol 试剂(Invitrogen，美国)，逆转录和荧光定量 PCR试剂盒(TaKaRa，美国)，MRP3 抗体(ABCAM，美国)，PXR、CPF、SP1、SH-PTP1 抗体均购自
15、 Santa Cruz公司，GAPDH 抗体(碧云天生物技术研究所)，山羊抗兔、山羊抗鼠二抗(北京中杉新桥科技有限公司)，BCA 蛋白定量试剂盒(Thermo，美国)。1.2 方法1.2.1 细胞存活率实验 细胞悬液接种于96孔板，每孔 200L，细胞密度约3 000/孔。待细胞贴壁后加入等体积含有不同浓度药物的培养基。设立阴性对照组外，同时设空白对照组(无细胞组)，目的是除外药物本身对吸光度值的影响。分别培养0、12、24、48、72h后加入浓度为5 mg/mL的无菌MTT(20 L/孔)，继续培养4h后弃去培养基，每孔各加150 L DMSO，振荡10 min后在自动酶联免疫分析仪上测定4
16、90 nm 波长处的光密度值。1.2.2 细胞培养及药物处理 在 37含 5 CO 2孵箱中，用 10胎牛血清的 1640 培养基培养 HepG2 细胞。待细胞生长密度达到 6070时，用 2低血清的培养液饥饿处理 12h，再加入川西獐牙菜(终浓度 50mol/L，含 DMSO 0.1) ，孵育 0h、12h、24h、48h、72h。阴性对照组加入终浓度为 0.1的无水酒精。阳性对照组加入终浓度为 100mol/L(含 DMSO 0.1)的 UDCA 。提取总膜蛋白及核蛋白的方法参照文献2。1.2.3 Real-time PCR实验检测肠分化标志物mRNA水平表达情况 按照Trizol试剂说明
17、书提取总RNA，将总RNA按PrimeScript RT reagent Kit with cDNA Eraser说明书(TaKaRa，美国)逆转录成cDNA。荧光定量PCR按SYBR Premix Ex Taq 说明书(TaKaRa，美国)操作。参照文献2的方法设置反应体系及循环条件，设计引物序列参照我们之前发表文献 2、16 。引物序列：MRP3(157bp)上游：5-AAAAGCAGACGGCACGACA-3，下游：5-GCAGGCACTGATG- AGGAAGC-3；SP1(821bp)上游：5-GCGTGGAGGAAGGAATAAGT-3，下游5-GTCAGGTCAGAGGGCATA
18、GC -3；PXR(117bp)上游：5-AGAGCGGCATGAAGAAGGAGATG-3，下游：5-GAAATGGGAGAAGGTAGTGTCAAAGG-3；CPF(149bp)上游：5-GCGTCCAGGAAGGAATAAGT-3，CPF下游：5-GTCAGGTCAGAGGGCATAGC-3；GAPDH(224bp)上游：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3。1.2.4 Western blot 检测分化标志物的蛋白表达情况 按文献2的方法提取细胞总膜蛋白以及核蛋白，用BCA法试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白样品与5SDS上样
19、缓冲液按41的比例充分混匀。核蛋白样品100加热变性5min，10 000r/min离心1min后使用。膜蛋白样品不必变性，直接上样。核蛋白30L和膜蛋白50L用10SDS-PAGE凝胶电泳分离，电湿转至PVDF膜。用5脱脂奶粉溶液室温封闭2h，然后加入一抗( MRP 32 000，PXR：1 200,CPF：1 200)孵育过夜。TBST洗膜后，加入相应二抗1500室温封闭2h，TBST洗膜4次，每次20min。条带上的免疫复合物经化学发光显色，凝胶成像仪成像。采用 Quantity-One 软件对条带的光密度值进行分析，蛋白的相对定量结果以实验条带光密度值/GAPDH或SHPTP1条带光密
20、度值表示。1.3 统计学方法用 SPSS 13.0 软件进行数据处理。计量资料以 x s 表示, 各组间组内比较采多因素方差分析。2 结果2.1 浓度为 50mol/L 的川西獐牙菜对 HepG2 细胞增殖无明显影响选用浓度为 25、50、75、100、125、150、175mol/L 的川西獐牙菜分别于 12、24、48、72h 处理 HepG2细胞，每个浓度设立五个复孔，然后运用计算公式抑制率=1-加药组 OD 值/对照组 OD 值得出每组的抑制率。Comment h2: 横坐标用时间，以剂量做曲线；如图 1所示，川西獐牙菜在浓度为 2550mol/L处理细胞时，药物对细胞的生存率基本在
21、20以下，所以我们选取这个区间中的最高浓度 50mol/L刺激细胞。这样选出作用浓度既对细胞无明显毒性作用又可以最好的测出本实验项目的变化情况。25mol/L50ol/L75mol/L10ol/L125mol/L150ol/L175mol/L02040608010 12h48h72制制制(制)图 1 不同浓度的川西獐牙菜对 HepG2细胞的抑制率2.2 川西獐牙菜可显著上调 HepG2细胞膜转运蛋白 MRP3的表达膜转运蛋白 MRP3是一种有机阴离子转运蛋白，可将毒性的胆酸从肝细胞基底侧膜向血液中排泌，再经由肾脏向体外排出，改善肝损伤 2-4。其增高可保护肝脏免受毒性胆酸造成的肝脏损伤。选用浓
22、度为 50mol/L的川西獐牙菜分别于 0、12、24、48、72h 的时间点处理 HepG2细胞，每个时间点分别设立 DMSO处理的阴性对照组和熊去氧胆酸(ursodeoxychiolic acid，UDCA)处理的阳性对照组。在 mRNA水平，与 DMSO处理的阴性对照组相比，川西獐牙菜处理 24、48、72h 后 HepG2细胞膜转运蛋白 MRP3的表达显著增高(24、48、72h 分别比阴性对照组高 0.68、1.46、2.10 倍， P0.05，图 2A)，MRP3 随着药物处理时间增加而增高更明显，UDCA 处理72h后也略增高（比阴性对照增高 0.87倍，P0.05，图 2C）。
23、在蛋白水平，川西獐牙菜处理 24、48、72h 后HepG2细胞膜转运蛋白 MRP3的表达显著增高(24、48、72h 分别比阴性对照组高 1.20、1.19、1.55 倍，P0.05，图 2C)，MRP3 在蛋白水平同样有时间依赖性，UDCA 处理组各时间点无明显变化。提示川西獐牙菜可显著增高 HepG2细胞膜转运蛋白 MRP3的表达，且有时间依赖性，作用明显强于 UDCA。Comment h3: 膜蛋白内参？图 2 荧光定量 PCR和 Western blot检测川西獐牙菜及利胆药 UDCA对 HepG2膜转运蛋白 MRP3表达的影响2.2 川西獐牙菜可明显上调核受体 PXR和 CPF的表
24、达核受体 PXR、CPF 对 MRP3的调控起重要作用。浓度为 50mol/L的川西獐牙菜分别于 0、12、24、48、72h的时间点刺激 HepG2细胞，每个时间点分别设立 DMSO处理的阴性对照组和熊去氧胆酸 UDCA处理的阳性对照组。在 mRNA水平，川西獐牙菜处理组 72h时 HepG2细胞核受体 CPF表达增高（比阴性对照增高 0.7倍，P0.05，图 3A），PXR 的表达在川西獐牙菜处理 24、48、72h 时显著增高（24、48、72h 分别比阴性对照增高0.99、2.12、2.13 倍， P0.05，图 3B）,PXR 随川西獐牙菜处理时间增加表达增高；UDCA 处理组中，C
25、PF 在Comment h4: 图 D、E 与 C不一致？24、48、72h 时表达均增高(24、48、72h 分别比阴性对照组高 1.11、1.07、1.29 倍， P0.05，图 3A),而 PXR在 24、48、72h 也增高(24、48、72h 分别比阴性对照组高 1.05、0.99、1.00 倍， P0.05，图 3B)。在蛋白水平，川西獐牙菜处理组在 48、72h 时 CPF表达增高(48、72h 分别比阴性对照组高 0.96、0.90 倍， P0.05，图3D)，川西獐牙菜处理后的 24、48、72h 时 PXR表达增高(24、48、72h 分别比阴性对照组高0.59、0.79、
26、0.60 倍， P0.05，图 3E)；UDCA 处理组中，CPF 蛋白表达在 48、72h 均增高(48、72h 分别比阴性对照组高 1.53、1.68 倍， P0.05，图 3A)，24、48、72h 时 PXR蛋白水平表达略增高(24、48、72h 分别比阴性对照组高 0.40、0.53、0.52 倍， P0.05，图 3E)。提示川西獐牙菜可使核受体 PXR、CPF 表达明显增高，有时间依赖性，且对 PXR的刺激作用高于 UDCA。图 3 Western blot 和荧光定量 PCR检测川西獐牙菜及利胆药 UDCA对 HepG2细胞核受体 PXR、CPF 表达的影响2.3 川西獐牙菜可
27、显著刺激 HepG2细胞核转录因子 SP1的表达核转录因子 SP1可与 MRP3的翻译启动区的 CG盒结合，作为催化剂增高 MRP3的表达 11 。同时可调控PXR、CPF 的表达。浓度为 50mol/L 的川西獐牙菜分别于 0、12、24、48、72h 的时间点刺激 HepG2 细胞，每个时间点分别设立 DMSO 处理的阴性对照组和 UDCA 处理的阳性对照组。与 DMSO 处理组相比，川西獐牙菜处理24、48、72h 时 HepG2 细胞膜核转录因子 SP1 的 mRNA 水平表达明显增高(24、48、72h 分别比阴性对照组高1.31、1.32、1.13 倍， P0.05，图 4A)，时
28、间点 24、48h 时蛋白水平表达也增高差异(24、48h 分别比阴性对照组高 0.66、0.52 倍， P0.05，图 4C)。UDCA 处理组的 mRNA 和蛋白水平在各时间点均无明显变化。川西獐牙菜可显著增高 HepG2 细胞核转录因子 SP1 的表达，且作用强于 UDCA。Comment h5: 图 C与 B不一致？Comment h6: 讨论中重复结果太多，建议修改；Comment h7: 有误？Comment h8: ？图 4 Western blot 和荧光定量 PCR检测川西獐牙菜及利胆药 UDCA对 HepG2细胞核转录因子 SP1表达的影响3 讨论胆汁淤积是由胆汁生成障碍或
29、和胆汁流动障碍所致的一组疾病共同的临床症状，是多种疾病如病毒感染、妊娠肝内胆汁淤积症、胆道梗阻等所致的临床综合症，也是直接导致肝细胞损伤、肝功能衰竭的主要因素。淤胆时多种肝细胞核受体、肝细胞酶及肝细胞膜转运体联合作用，发生一系列的变化，有利于降低肝内胆酸形成、增加胆酸排泌，达到降低肝内胆酸淤积、减轻毒性损伤的效果，这是肝细胞自我保护性反应 9。其中，细胞膜转录因子 MRP3在保护机制中起重要作用 1-4。MRP3(multidrug resistance protein 3,ABCC3)是一种诱导型有机阴离子转运蛋白，大部分位于肝细胞基底侧膜，在胆管上皮细胞、肠细胞也可见，可转运胆盐、雌二醇和
30、一些抗癌药物等 1-2。正常生理状态下，MRP3 含量很低。但在胆汁淤积的状况下，如胆道结扎后的大鼠、患有 PBC原发性胆汁性肝硬化及胰腺肿瘤压迫诱导的淤胆等的患者中，由于毒性胆酸盐大量积聚于肝细胞，MRP3 代偿性增高，可使毒性的胆酸从肝细胞基底侧膜向血液中排泌，再经由肾脏向体外排出，改善肝损伤 2-4。前期我们在胆汁淤积大鼠中发现，川西獐牙菜可以使血清肝损伤指标 ALT、AST 水平下降，降低胆汁酸水平，缓解肝脏损伤。但是其调节机制尚不明确。川西獐牙菜是否能有效刺激 MRP3的表达，从而发挥治疗胆汁淤积的作用成为本实验研究的重点。为此，本研究选用经典的被公认的 HepG2细胞系，首先通过
31、MTT实验选取最佳作用浓度，再通过 Werstern blot和荧光定量 PCR技术，发现川西獐牙菜处理24、48、72h 后 HepG2细胞膜转运蛋白 MRP3的 mRNA表达显著增高(24、48、72h 分别比阴性对照组高0.68、1.46、2.10 倍， P0.05)，效果明显优于 UDCA（72h 比阴性对照增高 0.87倍， P0.05）。川西獐牙菜处理 24、48、72h 后 HepG2细胞膜转运蛋白 MRP3的蛋白表达显著增高(24、48、72h 分别比阴性对照组高1.20、1.19、1.55 倍， P0.05)，而 UDCA处理组各时间点无明显变化。提示川西獐牙菜可显著增高 H
32、epG2细胞膜转运蛋白 MRP3的表达，且作用明显强于 UDCA。说明川西獐牙菜可通过增高细胞膜转运蛋白 MRP3的表达促进胆汁酸排泌减少淤胆时肝内毒性胆汁酸的聚集，且在细胞水平其对 MRP3的作用明显优于 UDCA，这可能为寻求优于 UDCA的治疗胆汁淤积性疾病的临床药物研究提供了线索。目前，MRP3 表达的调控机制尚不十分明确。文献1-4报道称核受体 PXR、CPF 和核转录因子参与诱导MRP3的表达。转录因子 SP1是一种 DNA结合蛋白，广泛存在于哺乳动物中，可特异性结合启动子区的 GC/TC盒，也可直接通过蛋白质-蛋白质的相互作用发挥协同转录功能 10。本课题组前期 2，6,11及其
33、他文献 10指出SP1可与 MRP3的翻译启动区的 CG盒结合，作为催化剂增高 MRP3的表达 11。本实验与之前 2,6,11报道一致，SP1表达与 MRP3表达呈明显的正相关。核受体超家族(nuclear receptor superfamily)是一组配体激活的转录因子家族，对肝脏的转录调控和内外源物质的新陈代谢起重要作用。PXR 是调控内源性胆汁酸和外源性药物的经典核受体之一，大量存在于肝脏中，在肾脏和肠道低表达，参与调节多种内外源化学物的解毒酶类及代谢转运体 1。PXR 可参与胆汁酸由细胞内向血液中转运，从而降低肝内胆汁酸水平，且 PXR 表达增高在诱导MRP3 表达中起重要作用 1
34、2。PXR 也可诱导 SP1 表达增高 16,17。CPF 主要存在于肝脏和胰腺中，是一种重要的孤儿受体。文献13-14报道指出，CPF 是 MRP3 的启动子，可上调 MRP3 的表达。同时 CPF 也是 SP1 的配体，可增高其表达 2。胆道结扎大鼠模型中，炎症因子 TNF- 可刺激核受体 CPF（大鼠 LRH-1）表达而上调MRP3/Mrp3 的表达 2。本研究发现川西獐牙菜可诱导核受体 CPF、PXR、SP1mRNA 和蛋白水平高表达。PXR 的 mRNA 表达在川西獐牙菜处理 24、48、72h 时显著增高（24、48、72h 分别比阴性对照增高 0.99、2.12、2.13 倍，
35、P0.05）,作用明显优于 UDCA 组(24、48、72h 分别比阴性对照组高 1.05、0.99、1.00 倍， P0.05)；PXR 的蛋白表达增高(24、48、72h 分别比阴性对照组高 0.59、0.79、0.60 倍， P0.05)，作用同样显著强于 UDCA 处理组(24、48、72h 分别比阴性对照组高 0.40、0.53、0.52 倍， P0.05)。川西獐牙菜处理组 72h 时 HepG2 细胞核受体 CPF mRNA 表达增高（比阴性对照增高 0.7 倍， P0.05）；48、72h 时 CPF 蛋白表达增高(48、72h 分别比阴性对照组高 0.96、0.90， P0.
36、05)。川西獐牙菜处理 24、48、72h 后 HepG2 细胞膜核转录因子 SP1 的 mRNA水平表达明显增高(24、48、72h 分别比阴性对照组高 1.31、1.32、1.13 倍， P0.05)，时间点 24、48h 时蛋白水平表达也增高(24、48h 分别比阴性对照组高 0.66、0.52 倍， P0.05)；UDCA 处理组的 mRNA 和蛋白水平在各时间点均无明显变化。可见川西獐牙菜显著增高 HepG2 细胞核转录因子 SP1 及核受体 PXR、CPF 表达，且可能参与了 MRP3 上调。在 MRP3 增高的同时，CPF、PXR、SP1 表达均增高，也与之前文献2,6,10-1
37、2，14-18报道一致，提示 MRP3 增高可能是通过 SP1、PXR、CPF 的表达上调起作用。但是，川西獐牙菜上调 MRP3 表达是否通过增高 CPF、PXR、SP1 而实现有关还有待进一步研究。川西獐牙菜是否还通过其他途径参与胆汁酸的调节也有待深层次的发现。虽然川西獐牙菜可在体外培养细胞中刺激 CPF、PXR、SP1 高表达，但在动物水平的作用还有待进一步的探索。但可以确定的是，川西獐牙菜在细胞水平可有效促进转运蛋白 MRP3、核转录因子 SP1、核受体 CPF 及 PXR 的表达，这些因子均可参与肝脏胆汁酸的解毒作用，可诱导毒性胆汁酸从肝细胞内向胆管排泌，再分泌到肾脏由肾脏排出体外，从
38、而减轻毒性胆汁酸积聚肝细胞而造成的肝损伤。综上所述，传统中药川西獐牙菜可显著诱导 HepG2 细胞膜转运蛋白 MRP3、核转录因子 SP1、核受体 PXR及 CPF 表达增高，且 MRP3 表达增高可能与 SP1、CPF、PXR 上调有关。本研究为中药川西獐牙菜在临床治疗胆汁淤积提供理论依据，同时为发掘我国珍贵中草药提供重要线索。参考文献：1 Scheffer GL, Kool M, de Haas M, et al. Tissue distribution and induction of human multidrug resistant protein 3J. Lab Invest 20
39、02，82:193-201.2 Jin Chai,Yu He, Shi-Ying Cai,et al. Elevated Hepatic Multidrug Resistance-Associated Protein 3/ATP-Binding Cassette Subfamily C 3 Expression in Human Obstructive Cholestasis Is Mediated Through Tumor Necrosis Factor Alpha and c-Jun NH2-Terminal Kinase/Stress-Activated Protein KinaseS
40、ignaling PathwayJ. Hepatology 2012，55(5):1485-94. 3 Soroka CJ, Lee JM, Azzaroli F,et al. Cellular localization and up-regulation of multidrug resistance-associated protein 3 in hepatocytesand cholangiocytes during obstructive cholestasis in rat liverJ. Hepatology 2001，33:783-7914 Bohan A, Chen WS, D
41、enson LA, et al. Tumor necrosis factor alpha-dependent up-regulation of Lrh-1 and Mrp3(Abcc3) reduces liver injury in obstructive cholestasisJ. J Biol Chem 2003，278: 36688-36698.5 Wu X P, Chai J, He Y. Relationship between hepatic membrane protein MRP3 and nuclear receptor Lrh-I in obstructive chole
42、stasisJ. Journal of Hepatopancreatobiliary surgery, 2008, 20(4): 232-234.6 Tzeng SJ, Chang WC, Huang JD. Transcriptional regulation of the rat Mrp3 gene promotor by the specicity protein (Sp) family members and CCAAT/enhancer binding proteinsJ. J Biomed Sci 2005，12:741-761.7 Lindor KD, Kowdley KV, L
43、uketic VA,et al. High-dose ursodeoxycholic acid for the treatment of primary sclerosing cholangitisJ. Hepatology. 2009，Sep;50(3):808-14.8 Corpechot C, Abenavoli L, Rabahi N,et al. Biochemical response to ursodeoxycholic acid and long-term prognosis in primary biliary cirrhosisJ. Hepatology. 2008，Sep
44、;48(3):871-7. 9Martin Wanger,Gernot Zollner,Michael Trauner,et al. New molecularinsights into the mechanisms of cholestasisJ.J Hepatology， 2009， 51:565-580.10 Su W, Jackson S, Tjian R, et al. DNA looping between sites for transcriptional activation: self-association of DNA-bound Sp1J. Genes & develo
45、pment, 1991, 5(5): 820-826.11 Chen W, Cai S Y, Xu S, et al. Nuclear receptors RXR: RAR are repressors for human MRP3 expressionJ. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 2007, 292(5): G1221-G1227.12 Jiang H, Chen K, He J, et al. Association of pregnane X receptor with m
46、ultidrug resistance-related protein 3 and its role in human colon cancer chemoresistanceJ. Journal of Gastrointestinal Surgery, 2009, 13(10): 1831-1838.13 Wagner M, Zollner G, Trauner M. Beyond PXR and CAR, Regulation of Xenobiotic Metabolism by other Nuclear ReceptorsJ. Nuclear Receptors in Drug Me
47、tabolism, 2008: 275-300.14Emina Halilbasic, Thierry Claudel, Michael Trauner. Bile acid transporters and regulatory nuclear receptors in the liver and beyondJ.Journal of Hepatology, 2013 58：155 168.15Liu Y H,Di Y M,Zhou Z W,et a1.Muhidrug resistance-associated proteins and implications in drug devel
48、opmentJ.Clin Exp Pharmacol Physiol,2010,37(1)：115-12016江恒, 陈健, 陈克力, 等. 沉默孕烷 X 受体增强结肠癌 LS174T 细胞对奥沙利铂敏感性的影响J. 第三军医大学学报, 2012, 34(1).17Flynn J M, OLeary M N, Zambataro C A, et al. Late life rapamycin treatment reverses agerelated heart dysfunctionJ. Aging cell, 2013.18何孝崇, 柴进, 何宇, 等. 阻塞性肝胆汁淤积下转录因子 NR5A2 和 SP1, 胆酸转运蛋白 MRP3 与肝脏损伤的相关性J. 第三军医大学学报, 2012, 24: 017.基本文献格式英文文献： 作者姓氏首字母用大写字母，其余用小写字母标注！专著： 著者.书名M.版本.出版地.出版者，出版年. 起页-止页专著中析出的文献： 作者（3 位+等或 et al）.题名A.见（In）：原文献责任者.书名M.版本.出版地：出版者，出版年. 起页-止页期刊中析出的文献： 作者（3 位+等或 et al）.题名J.刊名，年，卷（期）：起页-止页英文作者姓名录入方法： 姓（全称） 名（开头大写字母） 名（开头大写字母）
