1、上海交通大学硕士学位论文妊娠压力与铅联合暴露对大鼠子代学习记忆的影响及其机制探讨姓名：李筑英申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：颜崇淮20080501上海交通大学硕士论文 中文摘要 II 隐蔽平台试验中，后三组平均潜伏期均显著长于对照组，联合暴露组平均潜伏期均显著长于铅暴露组及压力暴露组( F=103.942, p0.05）；实验后，铅暴露组、压力暴露组的血清肾上腺酮水平均显著高于空白对照组（ F=296.425, p0.05)。 结论 妊娠期低水平铅暴露导致仔鼠体重显著减轻，未发现妊娠压力对大鼠仔鼠体重有显著影响，未发现妊娠压力能进一步增强妊娠期铅暴露对子代生长发育的影响。 妊娠压力与孕
2、期铅暴露对大鼠子代学习记忆的损害可能具有叠加作用。 妊娠压力与孕期铅暴露对促进子鼠应激情况下血清肾上腺酮的分泌上海交通大学硕士论文 中文摘要 III具有叠加作用。 妊娠压力与铅联合暴露下，未发现妊娠压力能显著增加铅在子代海马中的蓄积。 关键词 妊娠压力；铅；联合暴露；学习记忆 上海交通大学硕士论文 IVEffects of Prenatal Exposure to Stress and Lead on Spatial Learning and Memory of Developmental Rats. Abstract OBJECTIVE To explore the effects of p
3、renatal exposure to stress and lead on spatial learning and memory of developmental rats. METHODS 32 Sprague-Dawley pregnant rats were randomizedly divided into 4 groups: no maternal stress, no Pb exposure (NS/C); non-maternal stress, Pb exposure (NS/L), maternal stress, no Pb exposure (S/C), and ma
4、ternal stress plus Pb exposure (S/L).The spatial learning and memory ability, the serum corticosterone level both pre and post-testing of 30-day old offsprings, the blood lead level and lead concentration in hippocampus were tested by Morris water maze, competitive enzyme immunoassay, GFFAS and ICP-
5、MS. RESULTS The body weight of NS/L was significantly lower than NS/C, while the difference between NS/L and S/L was insignificant（F=37.282, p0.05).Post-testing level was different between NS/C and NS/L,NS/C and S/C (F=296.425, p0.05). CONCLUSION Prenatal joint exposure to restraint stress and lead
6、may increase the effect of single exposure on the spatial learning and memory ability and serum corticosterone level of offsprings, and the joint influence on corticosterone level may be the reason of further impairment of learning and memory. Key words: prenatal stress; lead; joint exposure; learni
7、ng and memory 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或
8、部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 上海交通大学硕士学位论文 1前 言 铅、汞、镉、砷、 锰等多种重金属元素具有神经发育毒性作用，暴露于这些毒性元素可能对儿童神经发育造成危害1-5。同样，一些社会因素如睡眠剥夺、妊娠期压力、社会经济状况等对儿童神经发育也会产生一定的损害6-8。因为人类同时生活在自然环境和社会环境中，有关社会环境不良因素与环境污染等理化因素同时作用对儿童健康的复合影
9、响也开始引起有关学者的关注9-11。 铅在地壳中广泛分布蕴藏量极大，因其低熔点、耐腐蚀、柔软性、良好延展性和可塑性，成为应用最广泛的金属之一。铅被广泛应用于各行各业，其生产、运输、销售和产品日常使用过程中均有可能造成环境污染。世界卫生组织2003年通报，铅在危害人类健康因素中已跃居第16位12。儿童与成人虽然处于同样的铅污染环境，但由于儿童处于生长发育的特殊时期，意外铅暴露的机会较多，对铅吸收率高、排泄率低，对铅的敏感性较成人高，因此铅对儿童的危害更大。铅对儿童发育的危害已被许多研究所证实。儿童血铅水平并无安全范围，任何水平的铅暴露对儿童的生长发育都是不利的；Lanphear BP等13对13
10、33名血铅浓度300g/L，智商平均降510分50。 随着现代社会竞争的激烈，工作和生活节奏加快，由妊娠导致的孕期压力（prenatal stress, PS）增加在许多人群中越来越明显，对母体和胎儿均有可能造成不利的影响。妊娠期精神压力对子代的影响已经成为人们关注的热点。有动物实验发现：妊娠期精神压力可导致自然流产、出生缺陷、早产、低出生体重等51。此外，妊娠压力能损害子代的学习记忆能力。受到妊娠压力的大鼠其子代在Morris水迷宫实验中平台潜伏期延长，被动回避训练中记忆得分下降52。 由此可见，妊娠压力可引起与铅相似的行为学损伤，两者对于行为及中枢神经系统的影响可能具有交迭作用。有学者认为
11、，与孤立地评价铅对机体的影响相比，同时考虑其它危险因素与铅的交互作用，能使评价更为准确53 。本次研究采用消化道染铅及束缚压力的方式，建立妊娠压力与铅联合暴露的大鼠动物模型，为进一步研究联合暴露对子代学习记忆能力的损害提供比较理想的动物模型。 1.2 材料和方法 1.2.1 研究对象 8-12周性成熟的Sprague-Dawley健康清洁级大鼠共64只，由中国科学院上海实验动物中心提供，雌性体重：220-250g，雄性体重：400g，雌雄比例为1：1。实验上海交通大学硕士学位论文 5动物环境设施符合I级标准（合格证号:SYXK 沪2003-0031）。室温2025，相对湿度为6080%，12小
12、时光照/12小时黑暗周期（光照周期8AM-8PM）。自由进食饮水，以清洁级饲料喂养。 1.2.2 主要试剂和仪器 主要试剂 分析纯级 醋酸铅 （PbAC2H2O） 美国Sigma公司 大鼠肾上腺酮试剂盒（DSL-80100） Diagnostic Systems Laboratories, Inc. USA 分析纯级 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2） 国药集团化学试剂公司 分析纯级 聚乙二醇辛基苯基醚 （Triton X-100） 美国Sigma公司 分析纯级 硝酸二氢铵（NH4H2PO4） 美国Sigma公司 氩气 （99.999%Ar） 上海成功气体公司 铅标准液 （批号Z-QPB0
13、2019） 美国Inorganic Venture公司 铅室内质控（批号HMB293IR03） 美国Kaulson公司 铅室间质控 （盲样） 美国CDC 主要仪器 智能放免gamma测量仪（SN-695A） 上海核所日环光电仪器有限公司 MQZ型原子吸收光谱仪 美国Thermo公司 4冰箱 青岛海尔公司 -80超低温冰箱 美国Thermo 公司 混合器（KANGJIAN XH-B） 江苏省姜堰市康健医疗器具有限公司 震荡器（KANGJIAN KJ-201A） 江苏省姜堰市康健医疗器具有限公司 孵箱 （恒字牌 PYX-DHS-4050） 上海跃进医疗器械厂 低温离心机 （TGL-16B） 上海安
14、亭科学仪器厂 主要耗材 一次性1ml ，2ml无菌注射器 西班牙BD医疗器械公司 一次性1.5ml Eppendorf管 美国Axygen公司 上海交通大学硕士学位论文 61.2.3 研究方法 1.2.3.1 动物分组和处理 本研究以8-12周性成熟的健康清洁级SD大鼠为亲代。适应性分笼喂养一周后，实验当天傍晚雌雄大鼠以1:1合笼，次日上午观察脱落的阴栓。阴栓阳性的雌鼠作为已受孕母鼠，记为P0，取出单笼喂养。 孕鼠随机分为4组：空白对照组（NS/C），铅暴露组（NS/L），压力暴露组（S/C），压力与铅联合暴露组（S/L），每组各8只。 各组处理方法如下： 铅暴露组为雌鼠自受孕起至哺乳期结束（
15、即子鼠出生第21天），自由饮用0.2%醋酸铅溶液。非铅暴露组饮用双蒸水。 压力暴露组于孕14-21天（妊娠晚期）给予束缚压力，每天3次，每次45分钟。方法：将压力暴露母鼠放入一直径6cm，长19cm的透明塑料容器内，容器顶部留有小孔，供孕鼠呼吸，束缚期内禁食禁水。压力刺激于日间有光照的12小时内完成，时间随机，避免大鼠对束缚刺激产生适应。非压力暴露组孕鼠置于空笼内，同样禁食禁水。 联合暴露组雌鼠孕期及哺乳期自由饮用0.2%醋酸铅溶液，并于孕14-21天给予束缚压力刺激。 母鼠生产当天为生后第1天，选取子代个数为8-13只的组群，剔除弱小，每窝保留8只留做实验。子代由母鼠喂养至生后第21天，离乳
16、并雌雄分笼喂养。各组子代均按性别各分为雌雄两组。 于各组母鼠孕21天，抽取鼠尾静脉血，待测血清肾上腺酮含量；于仔鼠出生后30天，心脏取血，待测血铅。 1.2.3.2 标本取材和制备 压力暴露组及联合暴露组孕鼠于孕21天接受束缚压力刺激后两小时内抽取鼠尾静脉血液以验证模型建立是否成功。空白对照组及铅暴露组于同天、同时间抽取鼠上海交通大学硕士学位论文 7尾静脉血。抽取1ml鼠尾静脉血，置于促凝管中静置20分钟，然后用离心机4500rpm分离20分钟，以获得血清，-80度冰箱保存，统一进行放射性免疫分析测定。 采血在清洁无铅环境下进行。于仔鼠出生后30天，每窝随机选取2只仔鼠，每组共计16只，用一次
17、性无菌注射器穿刺心脏，取血约1ml，注入加有20l的7%EDTA抗凝的Eppendorf管中，充分振摇混匀，密封后于-20保存。 1.2.3.3 标本检测 1.2.3.3.1 母鼠血清肾上腺酮含量的测定 母鼠血清肾上腺酮含量的测定步骤如下： 实验前从零度冰箱中取出所有试剂，使它们达到室温（25），然后轻轻地上下颠倒使其混匀。 为所有的物品，NSB，标准液，质控液，和样品准备双份的标签和试管。 吸取25l的标准液、质控液或标本于试管底部，对于NSB管则加入125l的0ng/ml的大鼠肾上腺酮标准液A。 每个试管中立即加入500l1-125大鼠肾上腺酮。 除了NSB管，所有试管中加入100l大鼠肾
18、上腺酮抗血清。 缓慢颠倒1-2分钟。 所有试管在37的温水中水浴60分钟。 在所有试管中加入1mL的反应液，并且马上颠倒。 所有试管在室温中（25）静置15分钟。 将所有试管在离心机中3000rpm离心15分钟。 将所有试管置于海绵架上同时翻转轻轻倒出里面液体，在吸收物质上停留1-2分钟。在试管倒回正面之前，轻轻敲击，以除去附壁的液体。否则，液体不去除干净将会导致数据不准确。 用智能放免gamma测量仪测定一分钟。 1.2.3.3.2 石墨炉原子吸收法检测仔鼠全血铅含量 原子吸收光谱仪的工作条件 上海交通大学硕士学位论文 8铅空心阴极灯波长283.3nm，电流8mA；高纯氩气为保护气体，流速2
19、50ml/min（原子化阶段停气）；进样量为20l；塞曼（Zeeman）背景校正；石墨炉的升温程序见表1。 表1 石墨炉的升温程序 Table1: Ramped temperature program of GFFAS 步骤 温度（） 升温时间（min） 保持时间（min） 气体流速（ml/min） 干燥1 130 25 5 250 干燥2 200 5 5 250 灰化 700 10 20 250 原子化 1600 0 5 0 净化 2400 1 2 250 上机检测的步骤 以0.5%Triton X-100、0.2%NH4H2PO4、0.2%HNO3为基质稀释液。取铅标准液（1g/L），用1
20、%HNO3稀释成0、100、200、300、400、500g/L 的标准系列，按1:9与基质稀释液彻底混匀，按上述仪器工作条件上机定标。 样品充分混匀，按1:9与基质稀释液彻底混匀，上机检测。检测过程中采用美国Kaulson公司提供的全血质控（低、高2个水平）和样品随机分析，严格执行实验室内部的质量控制。同时，通过参加美国疾病控制中心组织的每月定期的单盲法质量考察，保证检测结果的可靠性和与国际其他实验室的可比性。 1.2.3.4 数据分析 数据分析采用SPSS11.0软件。血清肾上腺酮含量、血铅含量均用均数标准差表示，依据资料特点，分别采用析因设计方差分析和单因素方差分析。实验结果的显著性水平
21、为p0.05)。见表5、图3。 1.3.2.2. 保持力试验结果 在保持力实验中，铅暴露组、压力暴露组在原平台所在象限逗留的时间均显著短于对照组（ F=40.146, p0.05)。见表6、图4。 上海交通大学硕士学位论文 18表4 各组仔鼠体重 ( X S，g) Table4: offspringsbody weight of 4 groups (X S，g) 出生后时间 空白对照组铅暴露组压力暴露组 联合暴露组D2 6.810.734.721.246.740.86 4.641.52D5 10.271.627.441.8810.131.49 7.311.47D10 18.022.3512.1
22、72.8417.862.13 11.832.58D15 27.144.3720.865.2927.243.86 20.474.82D20 38.374.8232.154.4838.195.27 30.965.03表5 子代隐蔽平台试验中的潜伏期比较.( X S，秒) Table5: comparation of offsprings time to find the platform in Morris water maze 上海交通大学硕士学位论文 19表6 保持力试验中各组子鼠在原平台所在象限逗留的时间比较 ( X S，秒) Table6: Comparation of offspring
23、s residence time in the quadrant of the primary platform in Morris water maze 组别 试验序列 性别 空白对照组 铅暴露组 压力暴露组 联合暴露组 Test 1 M 68.876.38 74.818.26 74.046.51 78.175.58 F 67.697.21 72.687.34 73.725.63 77.265.51 Test2 M 61.807.20 67.378.29 65.317.19 73.665.66 F 61.257.38 64.378.11 65.786.52 69.295.18 Test3 M
24、 55.447.35 60.997.56 58.667.16 67.815.02 F 55.017.57 58.018.39 59.966.87 63.375.26 Test4 M 48.216.32 56.557.79 51.797.13 61.144.92 F 48.466.71 53.268.33 52.796.81 56.645.15 Test5 M 43.093.91 54.007.59 46.866.02 55.495.06 F 42.934.49 50.355.79 47.496.63 53.014.71 组别 性别 空白对照组 (n=32) 铅暴露组 (n=32) 压力暴露组
25、(n=32) 联合暴露组 (n=32) M 27.755.07 25.424.76 20.963.45 16.083.40 F 26.894.73 24.554.43 20.652.98 15.723.33 上海交通大学硕士学位论文 20图2 各组仔鼠，日龄体重比较 Figure 2: offspringsbody weight of 4 groups on D2,D5,D10,D15,D20 各组隐蔽平台试验潜伏期30354045505560657075808512345天数时间(秒)空白组雄性空白组雌性铅暴露组雄性铅暴露组雌性压力暴露组雄性压力暴露组雌性联合暴露组雄性联合暴露组雌性图3 各
26、组仔鼠隐蔽平台试验潜伏期比较 Figure 3: comparation of offsprings time to find the platform in Morris water maze 图2 各组仔鼠，日龄体重比较 offspringsbody weight of 4 groups on D2,D5,D10,D15,D20 各组仔鼠体重051015202530354045day2 day5 day10 day15 day20体重(g)空白对照组铅暴露组压力暴露组联合暴露组 上海交通大学硕士学位论文 21各组保持力实验在原平台所在象限逗留时间051015202530组别时间(秒)雄性雌
27、性图4 保持力试验中各组仔鼠在原平台所在象限逗留时间比较 Figure 4: Comparation of offsprings residence time in the quadrant of the primary platform in Morris water maze 1.4 讨论 1.4.1 妊娠压力与铅联合暴露对子代生长发育的影响 铅具有生殖毒性、胚胎毒性和致畸作用，孕期低水平铅暴露可影响胎儿的宫内发育进程，引起仔代早产、出生体重低、智力障碍等78。同时该研究还发现，铅对体重增长的影响不具有性别差异。McMichael AJ等79认为，孕妇低水平铅暴露可增加早产的危险性，孕妇血
28、铅水平每上升10g/l，早产的危险度增加2. 8倍。Lafond J等80通过对30 例产妇进行低水平铅暴露下血浆、脐带和胎盘中钙水平分析发现，低水平铅暴露通过抑制胎盘合体滋养细胞钙吸收，干预钙的动态平衡，影响胎儿的生长发育。West WL等81研究发现，排除生殖系统感染后，生出低出生体重婴儿的妇女的血铅水平显著高于那些出生体重在2500g 以上的婴儿的母亲。Gonzlez-Cosso T等82进行流行病学调查显示，母亲铅暴露水平与婴儿出生体重呈负相关。本研究通 过饮水途径，对孕鼠进行孕期铅暴露，模拟孕期铅暴露情况。研究发现，与空白对照组相比，妊娠期铅暴露组仔鼠体重显著减轻，说明妊娠期铅暴露对
29、子代生长发育有显著影响，与文献报道一致。 上海交通大学硕士学位论文 22有研究者认为，妊娠期铅暴露对儿童生长发育的影响与铅暴露水平有关。Bellinger D等83对4354名孕妇进行流行病学调查发现，脐带血铅浓度150g/L时，胎儿生长发育不良的风险增加；而低于该水平时，影响不显著。 妊娠压力对母体和胎儿均有可能造成不利的影响。Alder J等21研究发现，孕期沮丧、焦虑等不良情绪与不良产科结果有关，并影响胎儿及新生儿的健康。关于妊娠压力是否影响子代体重，研究结果不一致。有动物实验显示，妊娠期精神压力可导致自然流产、出生缺陷、早产、低出生体重等76, 77。而Albina ML等84认为，妊
30、娠压力能引起母鼠子宫重量增加，但子代体重及其它生长发育指标无显著改变。本研究于孕14-21天给予孕鼠束缚压力，结果显示，与空白对照组相比，压力暴露组仔鼠体重差异不显著，未发现妊娠压力对大鼠仔鼠体重有显著影响。Lordi等85通过对DA HAN品系的大鼠研究发现：猫鼠同笼妊娠压力导致子代出生体重降低，但随着子鼠能自己进食，差异逐渐消失。笔者推测，妊娠压力对子代生长发育的影响可能与压力种类、强度等有关，因此上述研究得出的结论不一致；妊娠压力可能会引起子代出生体重的减轻，但该损害可随子代的自主进食而逐渐弥补、消失。 从整个生长过程来看，铅暴露组与联合暴露组仔鼠体重无显著差异，未发现妊娠压力能进一步增
31、强妊娠期铅暴露对子代生长发育的影响。 1.4.2 妊娠压力与铅联合暴露对子代学习记忆能力的影响 Morris水迷宫是英国心理学家Richard GM. Morris 于1981年发明并应用于学习记忆的研究中，现已广泛使用于行为神经科学领域,能比较理想地反映啮齿类动物空间学习记忆能力。现在，MORRIS水迷宫被广泛运用于啮齿类动物空间学习能力，海马功能或认知能力的测定。该测试是反映海马功能的敏感指标，能比较理想地反映啮齿类动物空间学习记忆能力86。本次研究中，我们采用该测试，于仔鼠30日龄开始，对各组子代进行学习记忆能力测试。 有关妊娠压力对子代学习记忆影响的研究结论不一致，有报道认为妊娠压力对
32、子代学习记忆能力的损害可能具有性别差异。Zimmerberg B87等发现产前应激的雌性后代空间学习能力受损，雄性无显著影响；而Szuran TF88, 89等报道晚期妊娠应激雄性子代学习能力下降，对雌性无显著影响。因此，本研究考虑到性别差异对学习记忆能上海交通大学硕士学位论文 23力损害的影响，分雌雄性别对大鼠子代进行水迷宫测试。 1.4.3.1 妊娠期铅暴露对子代学习记忆能力的影响 铅对儿童学习记忆能力的损伤已经被众多研究证实，并引起大众的广泛关注。低水平铅暴露可导致儿童智商降低90。胎儿期是中枢神经系统发育最快也最易受损害的时期74，Ronchetti R等75研究认为，出生前铅暴露比出
33、生后铅暴露对儿童的危害更大。Bellinger等91在美国波士顿,将249 名儿童根据脐血铅水平分为3组,用Bayley婴儿发育量表进行发育评价,发现精神发育指数(MDI)与脐血铅水平呈负相关。Schnaas L等92对175名儿童进行的队列研究中，分别测定其母亲孕期的血铅水平及儿童6至10岁的智商，结果显示孕期血铅水平与儿童智商有剂量-效应关系，说明母亲孕28后的铅暴露水平对儿童智力发育有重要影响，其影响具有持久性甚至可能延续终生。本次研究结果显示，与空白对照组相比，铅暴露组子鼠的学习记忆能力显著下降：在隐蔽平台试验中，铅暴露组仔鼠找到平台的平均潜伏期显著延长；在保持力试验中，铅暴露组仔鼠在
34、原平台所在象限停留的时间显著缩短。由此验证了妊娠期铅暴露对子代学习记忆能力的损害。 1.4.3.2 妊娠压力对子代学习记忆能力的影响 许多研究发现，妊娠压力能损害子代的学习记忆能力。Wu J等57于孕鼠13-21天给予束缚压力刺激，并于1月龄及3月龄对仔鼠进行Morris水迷宫实验，发现受到妊娠压力的大鼠子代在Morris水迷宫实验中平台潜伏期延长，被动回避训练中记忆得分下降。妊娠期急性或慢性压力会引起大鼠子代情绪反应增强，学习能力下降，运动发育迟缓和成年后社会性活动减少24-28。尽管妊娠期压力对子代的不良影响在人类研究中存在局限性,但是在一些回顾性和前瞻性研究中依然可以发现妊娠期压力对人体的不良后果:妊娠期压力可导致子代智力和语言功能水平下降，注意力受损，精神和运动发育的迟缓,甚至子代成年后精神异常等29-32。但Valle M等93却发现产前应激不改变子代空间学习和记忆能力。这些在不同妊娠压力刺激、不同实验条件下得到的结果的差异，可能与亲代压力给予形式，子代进行实验的时间、方式，实验动物的种类等有关。Zagron94则认为：这种差异性取决于压力刺激的大小，压力
