1、人干细胞标志 Musashi2 在急性髓系白血病细胞分化中的表达变化张慧娟，谭 诗，陈莎娜，王 娟，覃凤娴，陈先春， 张 伶 （400016 重庆，重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆市重点实验室）摘要 目的 探讨人干细胞标志 Musashi2（Msi2）在佛波酯（phorbol myristoyl acetate，PMA ）诱导急性单核白血病细胞株 THP-1 分化过程中的表达变化。方法 PMA 作用 THP-1 细胞 0、6、12、24 h 后，倒置显微镜下观察 THP-1 细胞形态学改变，计算分化细胞百分数；流式细胞仪检测 THP-1 细胞表面分化抗原 CD11b
2、的表达；定量 PCR 和 Western blot 检测 Msi2 的基因及蛋白表达水平；定量 PCR 检测 Msi2 下游信号分子 Numb 的 mRNA 水平；定量 PCR 和 Western blot 检测 Numb 下游分子Notch1 的 mRNA 和蛋白表达水平。 结果 PMA 处理 24 h 后可诱导 THP-1 细胞出现巨噬细胞样分化表型，实验组分化细胞的百分比显著高于未处理组（P0.05 ） 。同时 24 h 组 CD11b 表达量（59.308.7）较未处理组（0.320.08）显著增加（P0.05 ） 。实验组白血病细胞经 PMA 处理 24 h 后，Msi2 的 mRN
3、A 和蛋白相对表达量分别为（0.330.08）和（0.500.01） ，显著低于未处理组 （ P0.05） ；PMA 处理 12 h 后 Numb 的 mRNA 相对表达量为（ 2.920.33） ，较未处理组明显升高（P 0.05） ；而 PMA 处理 24 h 后 Notch1 的 mRNA 和蛋白相对表达量分别为（0.310.03）和（0.230.01） ，较未处理组显著下降（P0.05 ） 。结论 干细胞标志 Msi2 表达随 THP-1 细胞分化而下降，Msi2-Numb-Notch1 通路可能参与白血病细胞的分化调控。关键词 Musashi2；分化； 佛波酯；THP-1 细胞中图法
4、分类号 文献标志码 AThe Alteration of human stem cell marker Musashi2 in the differentiation of acute myelogenous leukemia cellZhang Huijuan, Tan Shi, Chen Shana, Wang Juan, Qin Fengxian, Chen Xianchun, Zhang Ling (Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics, Ministry of Education, Department of Laborat
5、ory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)Abstract Objective To determine the alteration of Musashi2(Msi2) , a human stem cell marker in the differentiation of human myelomonocytic leukemia cell line THP-1 induced by phorbol myristoyl acetate (PMA). Methods Within 0, 6, 12
6、and 24 h PMA treatment in the THP-1 cells, The morphological changes of cells were observed under the inverted microscope. The proportion of differentiated cells was calculated. The expression of CD11b, THP-1 cell differential surface marker was assayed using flow cytometry (FCM). Real-time PCR and
7、Western blotting were employed to test the mRNA and protein expression of Msi2. The expression of Msi2 downstream signal molecule Numb was detected by Real-time PCR. The mRNA and protein expression of Notch1, Numb downstream signal molecule were detected by Real-time PCR and Western blotting too. Re
8、sults The THP-1 cells treated by PMA for 24 h had differential phenotype of macrophagocyte. The proportion of differentiated cells in the experimental group was higher than that in the untreated group significantly(P0.05) Simultaneously the expression of CD11b was increased in the 24 h group（59.30 8
9、.7）markedly compared with the untreated group（0.320.08） (P0.05) . The mRNA and protein relative expression of Msi2 were （0.330.08）and （0.500.01）in the leukemia cells treated by PMA for 24 h respectively, which were much lower than that in the untreated group (P0.05). Numb mRNA relative expression wa
10、s （2.92 0.33）after PMA treatment for 12 h, which was much higher than that in the untreated group (P0.05). However, When cells were treated by PMA for 24 h the mRNA and protein relative expression of Notch1 were （0.310.03）and（0.230.01）respectively ，which were decreased significantly compared with th
11、at in the untreated group. (P0.05). Conclusion The expression of stem cell marker Msi2 reduces significantly during the differentiation of THP-1 cells. Msi2-Numb-Notch1 pathway may regulate the differentiation of leukemia cells.Key words musashi2;differentiation;phorbol myristoyl acetate;THP-1 cellS
12、upported by Natural Science Foundation of Science and Technology Commission of ChongQing（CSTC2010BB5363）. Corresponding author: Zhang Ling ,基金项目 重庆市科委自然科学基金（CSTC2010BB5363）通信作者 张 伶，E-mail: 白血病是血液系统恶性肿瘤，一个重要的发病机制是白血病细胞分化成熟障碍。若调控造血干细胞分化的关键基因失调，将导致白血病的发生。Musashi2（Msi2 ）是一种 RNA 结合蛋白，最早在神经干细胞中发现可参与调控神经干细
13、胞的分化发育 1。2010 年 Kharas 等 2在造血干细胞中发现 Msi2 高表达，Msi2 可抑制早期粒系和巨核系的分化。同时在慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）中也证实高表达 Msi2，且在 CML加速期或急变期显著高于慢性期，过表达 Msi2 可以促使 CML 由慢性期进入加速期或急变期 2。这提示Msi2 可能在白血病发生、发展中发挥重要作用。目前关于 Msi2 在急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）中的研究主要限于临床资料的统计分析，其在 AML 发生、发展中的具体作用机制尚不清楚。因此
14、，本研究以急性髓系白血病细胞株THP-1 为细胞模型，观察 PMA 处理后 Msi2 及下游信号分子 Numb 和 Notch1 在急性髓系白血病细胞分化中的表达变化，初步探讨 Msi2 在白血病发生、发展中的重要作用。1 材料与方法1.1 主要试剂佛波酯药物购自上海碧云天生物技术有限公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司，RPMI1640 培养基购自 Gibco 公司，RNA 提取试剂 RNAiso Plus 及定量 PCR 试剂SYBR Premix Ex TaqTM 均购自 TaKaRa 公司，CD11b-PE 单克隆抗体购自北京四正柏生物有限公司，兔抗人 MSI2 单克隆抗体（a
15、b76148）购自 Abcam 公司，兔抗人 Notch1 多克隆抗体购自 Anbo 公司，鼠抗人 -actin 单克隆抗体，羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2 细胞培养及 PMA 处理急性单核白血病细胞株 THP-1 购自上海生命科学院，用含 10%的胎牛血清，青霉素（100 U/ml） 、链霉素（100 U/ml）和 L-谷氨酰胺（2 mmol/ml）的 RPMI1640 培养液于37，5% CO2 的条件下培养。 PMA 处理细胞终浓度为 50 nmol/L。 1.3 光镜下细胞形态学观察50 nmol/L PMA 作用 THP-1 细胞 0、6、12、24
16、 h，倒置显微镜下观察不同处理时间下的细胞形态改变。计数 300 个细胞，计算 PMA 处理不同时间下形态发生改变的 THP-1 细胞占的百分数。1.4 FCM 检测 CD11b 的表达PMA 作用 THP-1 细胞 0、6、12、24 h 后，胰酶消化，用含 0.2% BSA 的 PBS 洗 2 次，调整细胞密度为 106 个/100 l 的细胞悬液。加入 10 l CD11b-PE 单克隆抗体，避光，冰上孵育 30 min，再次用含 0.2% BSA 的 PBS 洗 2 次，流式细胞仪检测 CD11b 的表达。1.5 定量 PCR 检测 Msi2、Numb 及 Notch 1 的mRNA
17、表达用 RNAiso Plus 试剂提取总 RNA，按 TaKaRa 试剂盒将RNA 逆转录成 cDNA，为定量 PCR 做准备。定量 PCR 总体系包括：2SYBR Premix Ex TaqTM ，去离子水，PCR 上游引物，PCR 下游引物，模板 cDNA。各基因引物及产物长度见表 1。反应程序如下：预变性 95 30 s; 变性 95 30 s，退火 20 s（Msi2 为 56 ， Numb 为 56 ，Notch1 为61.4 ） , 延伸 72 30 s，72 采集荧光，共 39 个循环。融解曲线条件：(65 95 ) 每上升 0.5 采集 1 次荧光。反应体系在 BIO-RAD
18、 仪器上进行，结果用 2CT 表示。表 1 引物序列及长度基因 序列 5-3 产物长度（bp）msi2 上游：GTTATCTGCGAACACAGTAGTG下游：ACCCTCTGTGCCTGTTGGTAG 110numb 上游：GGCTCTTTCCGAGGTTT下游：GTGCTGAAGGCATTGGT 197Notch1 上游：CTCCCCGTTCCAGCAGTCTC下游：CAGCCACTCGCATTGACCAT 123-actin上游：TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG下游：TGCTGTCACCTTCACCGTTC 1561.6 Western blot 检测 Msi2 和 Not
19、ch1 的蛋白表达收集 PMA 诱导 0、6、12、24 h 的 THP-1 细胞并提取蛋白。各组取 100 g，经 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转至 PVDF 膜上。5%脱脂奶粉封闭液室温封闭 3 h，加入封闭液稀释的一抗 (Msi2，12 000；Notch1, 12 000；-actin，1500) 4过夜。TBST 洗 2 次，10 min/次；TBS 洗 1 次，10 min。加入 TBST 稀释的二抗 (anti-rabbit 11 000；anti-mouse 11 000) 室温孵育 1 h，洗膜。用化学发光显色试剂进行显色，用 Quantity One 软件
20、分析条带灰度值。1.7 统计处理实验数据用 SPSS 17.0 软件进行分析，计量资料用 sx表示。样本之间的比较采用单因素方差分析。2 结果2.1 白血病细胞诱导分化过程中形态学改变PMA未作用时THP-1细胞呈悬浮成簇生长，经50 nmol/L PMA处理后，随着作用时间的延长，贴壁细胞的数量逐渐增加，同时细胞形态出现巨噬细胞样分化表型：胞体由圆形转变成椭圆形、梭形，部分细胞膜开始开始伸出伪足，甚至呈分枝状（图1 A、B 、C、D箭头所指） 。实验组中细胞经PMA处理12 h和24 h后分化细胞百分比分别为（1.590.18）% 和（3.770.25）%，显著高于未处理组 （0.110.0
21、5）% ，差异具有统计学意义（P0.05 ） 。A、B、C、D： PMA 作用 THP-1 细胞 0、6、12、24 h 时的细胞形态（400, 箭头所指是形 态发生改变的细胞）图 1 不同时间 PMA 处理 THP-1 细胞后细胞形态学变化2.2 白血病细胞诱导分化过程中 CD11b 表达的改变PMA 作用 THP-1 细胞后，随着 PMA 处理时间的延长，THP-1 细胞表面分化抗原 CD11b 表达逐渐增高。与未处理比较， PMA 处理 24 h（59.308.7 ）时 CD11b 阳性细胞的百分比显著高于未处理组（0.320.08） ，差异具有统计学意义（P0.05） （图 2） 。A
22、：0 h；B：6 h；C：12 h；D：24 h图 2 不同时间 PMA 处理 THP-1 细胞后 CD11b 的表达2.3 白血病细胞诱导分化过程中 Msi2 表达的改变PMA 作用 THP-1 细胞 24 h 后， Msi2 的 mRNA 相对表达量为（0.330.08） ，较未处理组明显下降（P0.05） （图3A） 。此外，PMA 处理 THP-1 细胞 24 h 后 Msi2 的蛋白相对表达量为（0.500.01） ，与未处理组比较有显著性下降（P0.05） （图 3B，C） 。A：定量 PCR 检测结 果；B: Western blot 检测结果；C:半定量分析结果 1：0 h；2
23、：6 h；3：12 h；4：24 h；a: P0.05, 与 0 h 比较 图 3 不同时间 PMA 处理 THP-1 细胞后 Msi2 mRNA 和蛋白的表达2.4 白血病细胞诱导分化过 程中 Msi2 下游信号分子的改变定量 PCR 结果显示，PMA 处理细胞 12 h 后，THP-1 细胞的 Numb mRNA 水平显著升高（2.920.33） ，较未处理组有显著性差异（P0.05 ） （图 4A） 。PMA 处理细胞 24 h 后Notch1 的 mRNA 和蛋白相对表达量分别为（ 0.310.03）和（0.230.01） ，较未处理组明显下降，差异具有统计学意义（P0.05） （图
24、4B，C，D） 。A：Numb mRNA 的表达；B：Notch1 mRNA 的表达;C:Notch1 蛋白的表达；D:Notch1 蛋白表达的半定量分析 1：0 h；2：6 h；3：12 h；4：24 h；a: P0.05, 与 0 h 比较图 4 不同时间 PMA 处理 THP-1 细胞后 Numb 和 Notch1 的表达3 讨论急性髓系白血病是一类由造血干细胞异常引起的恶性克隆性疾病，具有自我更新、多向分化和无限增殖潜能的白血病干细胞是形成白血病的“罪魁祸首” 。人干细胞分子 Msi2 具有维持胚胎干细胞自我更新和多潜能特性，在胚胎干细胞的早期分化中起着重要的调控作用 3。最近发现，M
25、si2 可能参与白血病的发生发展，临床上发现 AML 患者高表达Msi2 和患者的生存率呈负相关， Msi2 可作为 AML独立的预后标志之一 4。然而， Msi2 与 AML 分化阻滞的关系尚不清楚。为了观察 Msi2 在 AML 细胞分化过程中的表达改变，本研究采用 PMA 处理 THP-1 细胞， 发现PMA 能够诱导 THP-1 细胞出现巨噬细胞样分化表型的改变，同时伴有分化抗原 CD11b 的增加。白血病细胞在 PMA 诱导分化的过程中，Msi2 的 mRNA 和蛋白表达水平显著下降。Kharas 等 2在研究正常造血干细胞分化时发现，随着造血干细胞逐渐分化为祖细胞以及成熟的血细胞，
26、Msi2 的表达逐渐下降。de Andres-Aguayo L 等 5也发现 Msi2 高表达于造血系统内的原始细胞，并随原始细胞的分化而急剧下降。研究 6表明， Msi2 可通过调控 Numb-Notch 途径参与慢性粒细胞白血病的分化。Numb 是不对称细胞分裂子，它与细胞的分化有直接的联系 7。Notch 信号通路和肿瘤的分化，增殖，凋亡有着广泛联系 8。在慢性粒细胞白血病中，Msi2 可以阻止 Numb 蛋白的表达 6，而 Numb 可以抑制 Notch 信号通路的表达9。因此，Msi2 可通过 Numb-Notch 途径上调 Notch表达，从而促进慢性粒细胞白血病的进展。但目前Ms
27、i2 以及 Numb/Notch 信号通路与 AML 分化的关系少见文献报道。为此，我们在观察急性髓系白血病诱导分化过程中 Msi2 改变的同时，首先检测了THP-1 细胞中 Numb 的表达改变。结果表明， Numb的 mRNA 表达的整体趋势是随着 PMA 诱导 THP-1细胞分化增加而增加，和 Msi2 的表达下调刚好相反。Ito 等 6报道在慢性粒细胞白血病中，Msi2 可以抑制Numb 蛋白的表达，若 Msi2 的基因缺失则可以恢复Numb 的表达，这与本研究观察到 Numb 与 Msi2 表达呈负相关的结果是相符的。已知 Notch 包含 4 个亚型，其中只有 Notch1 能被所
28、有的 Numb 亚型抑制10。因此本研究重点检测 AML 细胞分化过程中Notch1 的基因和蛋白表达水平改变。结果发现Notch1 的表达随着 THP-1 细胞的分化而下降，和Msi2 表达的改变相一致。本研究探讨了人干细胞标志 Msi2 在急性髓系白血病细胞分化中的表达变化，随着 THP-1 的诱导分化，Msi2 表达下降的同时伴随着其下游 Numb 分子的上调和 Notch1 分子的下调。下一步的研究将通过干预 Msi2 及其下游 Numb/Notch1 信号分子的表达，观察白血病细胞分化表型的相应改变，从而明确Msi2 及下游 Numb/Notch 信号通路在急性髓系白血病细胞分化中的
29、重要作用。探讨 Msi2 在急性髓系白血病分化中的调控作用，有助于阐明白血病的发病机制和寻找白血病治疗的潜在靶点。参考文献：1 Sakakibara S, Nakamura Y, Satoh H, et al. Rna-binding protein Musashi2: developmentally regulated expression in neural precursor cells and subpopulations of neurons in mammalian CNSJ. J Neurosci, 2001, 21(20): 8091-8107.2Kharas M G, Len
30、gner C J, Al-Shahrour F, et al. Musashi-2 regulates normal hematopoiesis and promotes aggressive myeloid leukemiaJ. Nat Med, 2010, 16(8):903-908.3 Wuebben E L, Mallanna S K, Cox J L, et al. Musashi2 is required for the self-renewal and pluripotency of embryonic stem cellsJ. PLoS One, 2012, 7(4):e348
31、27.4 Byers R J, Currie T, Tholouli E, et al. MSI2 protein expression predicts unfavorable outcome in acute myeloid leukemiaJ. Blood, 2011, 118(10): 2857-2867.5 de-Andres-Aguayo L, Varas F, Kallin E M, et al. Musashi 2 is a regulator of the HSC compartment identified by a retroviral insertion screen
32、and knockout miceJ. Blood, 2011, 118(3): 554564.6 Ito T, Kwon H Y, Zimdahl B, et al. Regulation of myeloid leukaemia by the cell-fate determinant MusashiJ. Nature, 2010, 466(7307):765-768.7 El-Hashash A H, Warburton D. Numb expression and asymmetric versus symmetric cell division in distal embryonic
33、 lung epitheliumJ. J Histochem Cytochem, 2012, 60(9):675-682.8 Purow B. Notch inhibition as a promising new approach to cancer therapyJ. Adv Exp Med Biol, 2012, 727:305-319.9 Song Y, Lu B. Interaction of Notch signaling modulator Numb with -Adaptin regulates endocytosis of Notch pathway components and cell fate determination of neural stem cellsJ. J Biol Chem, 2012, 287(21):17716-17728.10 Beres B J, George R, Lougher E J, et al. Numb regulates Notch1, but not Notch3, during myogenesisJ. Mech Dev, 2011, 128(5/6):247-257.(收稿：2012-08-15；修回：2012-10-25)（编辑 王 红）
