1、 复旦大学博士学位论文人肝癌侧群细胞的分选及鉴定姓名：何义舟申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：樊嘉20070409中文摘要我国肝癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中均排第二位，占全球每年因肝癌死亡一步法骨髓造血干细胞分选时分离出的弱荧光信号细胞群。这群细胞在总量上只占鼠的骨髓、骨骼肌、神经系统等处均有发现。最近的研究证实，人乳腺癌、肺癌、胶质母细胞瘤体外传代细胞系中也可分离出细胞。研究表明，这些细胞高表达转运蛋白疊，并大多同时表达有相应肿瘤干细胞的标记分子。疊定位于细胞膜，具有“泵”的功能，因此细胞可将许多细胞毒化疗药物排出细胞外，从而使肿瘤对化疗药物产生耐药性。接种免疫双缺陷品系的小的干细胞
2、分子标记的情况下，细胞可作为肿瘤干细胞鉴定的一种重要途径。T说鞍譇与细胞表型的关系在无血清培养基中，非细胞侵袭能力显著高于细胞，分别为都没有成瘤。细胞的成瘤能力显著强于非细胞。甅法检测化疗药对细胞生长活力的影响我们用觳釹赴头荢赴曰埔的耐药性。结果显示，化三、临床肝癌标本原代培养细胞中侧群细胞的检测我们这部分的工作主要是检测临床肝癌组织标本中原代培养的细胞中是否存在细胞，以及细胞的生长特性与病人临床表型的相关性我们收集复旦大学附属中山医院肝癌研究所年轮月手术切除肝癌标本例，胶原酶法消化细胞，制成单细胞悬液，再按传统的方法进行染色后流式细胞检测原代培养细胞中的细胞。结果显示，部分临床肝癌标本原代培
3、养细胞中存在细胞，中文摘要相关： 琣 瓼 博士论文 疊 疊珺 痶 琲 荚文摘要 甌轒瓾 瓵 簊 ， 甪 痭 觱。 ，发率高达，即使小肝癌也达伟鹾笞R 聘捶 已成为阻碍肝癌无法分离干细胞的情况下，细胞被认为是一种有前途的生物学方法。本课题的目的是在我所已建立的遗传背景相似、不同转移潜能肝癌细胞株的基础上，检测并分选细胞，探索其生物学功能及其与临床肝癌复发转移的关系。然后上流式细胞仪检测细胞的表达甅盅龅腟赴孟赴庖咦榛琖结论：博士论文 第一部分表型的的必要条件，并且是肿瘤细胞耐药的主要因素。制，分析细胞和肿瘤的转移潜能是否相关。材料与方法滤器过滤，分装，姹芄獗妗甆瓾氯仿：国产分析纯。：第一链合成试剂
4、盒，美国。，美国。 篜，美国。 镄蛄校河缮虾锕逃邢薰竞铣伞疉 考马斯亮兰：国产分析纯。胰蛋白酶：购自甎瓵国。色素：购自上海试剂三厂渲梅椒撼迫第一部分色素，放入陶瓷研钵中，加入分析纯甘油研磨，然后加入分析纯甲醇，僚踅夯撼逡海，。磷R苹撼逡海转移缓冲液：甲醇：狪：封闭液和阎谭廴苡型，。免疫组织化学专用湿盒：北京中山生物技术公司。免疫组织化学专用抗原修复架及修复盒： 北京中山生物技术公司高压锅：瓜公司。注射器、针头等：上海医疗器械厂产品。无傅谋”赑管： ，美国。第一部分，充分混匀，待冷却。管中。胄模#分钟，弃上清。臀露炒妫航炒婀芊湃胧孪茸坝 赴此眨喝诨赴涸的烧杯中加入温水，用温度表指示，调节浮细胞，
5、移入 嘌恐校儆毫升培养液冲洗离心管后加入培养瓶，放入培养箱中，、饱和湿度培养。过夜后观察，见相邻细胞已经连成小片落，死亡细胞飘浮在培养液中。将全培养瓶，继续培养。魇较赴盅赴取对数生长期状态较好的赴票赋膳任的单细胞另外一组加入维拉帕米公司，货号，终浓度为孵育 ，每隔 混匀一次；分选，封闭。危看代替一抗作为阴性对照。瓵昙堑难蚩雇肐：孵育。獴琋和结果观察：细胞膜或者细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性染色，如阳性颗粒数检测鞍自趕赴头荢赴械谋泶铩叼赴艿鞍滋崛。阂让赶硐赴蛴孟赴蔚痘竦孟赴琍洗涤两次分离胶浓缩胶的灌制蛋白质电泳第一部分爰状耄笫椅抡舾杉状至少。庖呒觳饧癊化学发光平铺于膜上，然后将膜反向盖于其上，轻轻
6、赶走气泡，室片保存。试剂，用枪头反复吹打混匀，移入的胄种樱琑即保留在上层水相中；水溶解保存；酆厦噶词椒从灭菌去离子水至总体积第一部分聚合酶 痷钟；变性秒，退火秒，延伸秒，共个循环；延伸 制各琼脂糖凝胶：三角烧瓶中加入碇欠奂上样：取从罫样孔内：另取分子量标准同时上样：将凝胶置入，第一部分瓵与细胞第一部分可明显看出左下角有一群细胞呈低荧光强度细胞明显减弱甚至消失，表明了这群细胞的特性第一部分图赴庖咦榛峁允続蛋白在细胞高表达实验实验下可以分化为多种组织细胞类型。分选细胞的原理主要是细胞能够泵出染料，使细胞不着色。蛋白造成的，由因被称作綾第一部分转染细胞使该基因高水平表达，发现细胞对的排出能力大大提高。证
