1、 中国西门塔尔牛 PPP1CB 和 ACSL4 基因多态性及与屠宰性第一篇 文献综述第一章 PPP1CB 基因的研究概况PPP1CB 基因编码的蛋白质是蛋白磷酸酶 1PP1）催化亚基中的一个。蛋白磷酸酶 PP1 是主要的丝-苏氨酸蛋白磷酸酶，能够使磷酸化的蛋白质脱磷酸2。根据丝- 苏氨酸蛋白磷酸酶的理化性质的不同，可以把这些酶大致分成四类：磷蛋白磷酸酶 1PPP1 或 PPP1C），磷蛋白磷酸酶 2APPP2A），钙调磷酸酶 PPP2B）和 Mg2+依赖型磷酸酶 PPP2C）。PPP1 PPP1C），PPP2APPP2AC） 和 PPP2B 的催化亚基属于同一基因家族，拥有 40%相似的基因序
2、列，与 PPP2C 基因的序列差异较大3。磷蛋白磷酸酶 PPP1）有三个亚型： PPP1，PPP1(由 PPP1CB 基因编码合成），PPP1PPP11 和 PPP12）4。PPP1 参与调节众多生理活动：如细胞内糖代谢、钙转运、肌肉收缩、基因表达、蛋白质合成和代谢、细胞分裂、细胞凋亡、膜受体和通道的调节等2 。而国内外对 PPP1CB 基因与牛屠宰性状相关性的报道甚少，仅有研究表明，PPP1CB 基因在梅山猪和大白猪与梅山猪的杂交后代中表达水平的不同与腰背最长肌性状相关4。因此，本研究首次揭示了 PPP1CB 基因与中国西门塔尔牛屠宰性状的相关性，为进一步研究 PPP1CB 基因的基因功能及
3、中国西门塔尔牛的选种选育提供了理论依据。1.1 蛋白磷酸酶 1 的结构特征与底物特异性蛋白磷酸酶 1 普遍存在于真核细胞中，是主要的丝-苏氨酸蛋白磷酸酶，拥有众多的功能。与它的众多功能相对应的是 PP1 拥有众多亚基，从而可以与众多底物相互作用实现多种生理功能。但是，对于特定亚基形成的蛋白磷酸酶具有严格的底物特异性，从而能够实现特定的生理功能。每个特异性的 PP1 酶由催化亚基和调节亚基R 亚基）组成。在真核生物中，PP1 的催化亚基是高度保守的，亚基之间有 70%或者更高比例的蛋白序列一致性，所有的 PPP 家族都含有一个相似的活性部位。现在至少发现了 100 个能够与 PP1 作用的调节亚
4、基，还可能有更多的调节亚基目前尚未发现4。在不同的真核生物系谱中，分析已知的调节亚基显示，调节亚基的数目随着多细胞生物的进化迅速增长5。这些调节亚基有的可将 PP1 催化亚基定位到特定的亚细胞室，有的用来调控底物特异性，有的则作为底物本身。因此，催化亚基和调节亚基之间的特异性结合直接关系到 PP1 的功能。PP1 的催化亚基采用紧密的 / 折叠，一个 折叠嵌入到两个 螺旋区域之间6如图 1.1A）。两个金属离子：Mn2+ 和 Fe2+位于活性区域，连接着 折叠和两个 螺旋。这两个金属离子与三个组氨酸，两个天冬氨酸和一个天冬酰胺相连接，这些氨基酸残基在所有 PPP 酶家族成员中都是高度保守的如图
5、 1.1B），说明了在这个蛋白家族中有共同的金属离子催化反应机制。这两个金属离子激活一个水分子，启动对磷原子的亲核攻击6, 7。在各折叠区域之间形成了三个较浅的粗糙表面凹槽，汇集到催化反应中心，形成了一个 Y 字形的表面结构如图 1.1B），这个结构能够紧密结合肿瘤诱导产生的毒素，例如微囊藻素和冈田酸通过与催化中心的氨基酸相互结合，使其与活性中心紧密相连。1.2 磷蛋白磷酸酶 1 亚基的分类可逆的蛋白磷酸化在细胞生理活动中扮演着重要的作用，此过程分别由蛋白激酶使蛋白质磷酸化）和蛋白磷酸酶使磷酸化蛋白质去磷酸化）来完成24。蛋白磷酸酶按其接受磷酸化/ 脱磷酸化基团的不同，主要分为丝/苏氨酸蛋白磷
6、酸酶 STPPs），酪氨酸蛋白磷酸酶及兼有丝/苏及酪氨酸蛋白磷酸酶。STPPs 对靶蛋白的特异性作用，不仅取决于不同的催化亚基，更依赖于作用于它们的调节亚基的不同而具有不同的功能25。磷蛋白磷酸酶 1Phosphoprotein phosphatase 1, PPP1）有三个亚型： PPP1，PPP1( 由 PPP1CB 基因编码合成）， PPP1PPP11 和 PPP12）4。磷蛋白磷酸酶 1 由一个催化亚基 PPP1C）和糖原调节亚基组成，又称调节亚基 PPP1R orPPP1 interacting protein, PIP）26。在 20 世纪 40 年代人们就发现 PPP1 能够将蛋
7、白酶 a 转化为蛋白酶 b。许久后才发现， PPP1 在细胞代谢中具有广泛的作用，包括细胞增殖和分化，细胞凋亡，蛋白质合成，细胞骨架重组，信号传导，膜受体和通道的调节，癌基因转化等诸多方面27。在随后的 20 年中，先后发现了 PPP1200 多个调节亚基，这些亚基能够将 PPP1C 定位到特定的细胞区域，调节底物特异性，调节催化活性，或者直接作为基底25, 27, 28。1.3 磷蛋白磷酸酶不同亚基的功能Terrak 等人13 已经解析出了磷酸蛋白酶 C 末端与 N 末端的结构，经典的 PPP1CA 和 PPP1CC1 蛋白结构是以第七个亮氨酸开始，以第 299 个丙氨酸在 PPP1CB 中
8、是丝氨酸）结束。这就意味着在蛋白序列的 C 末端有 25-30 个可变的氨基酸序列，根据 Terrak 等人13 的报道，PPP1CB 蛋白从 300 谷氨酸到 309 甘氨酸是在两组重复的 MYPT1 调节亚基之间。这一规律性，显示 PPP1C 灵活的 C 末端结构与特定调节亚基结合决定了蛋白的特异性。最近的研究显示，N 末端的 MyPhoNE 对于酶的特异性有重要的影响。相比之下，如果考虑到 neurabins 亚基与 PPP1CC1 的特异性结合的结构特点，蛋白磷酸酶的结构基础仍然是不确定的，因为 neurabin II 的 N 末端和 C 末端并不与磷酸酶结合。此外，neurabin
9、II 与 PPP1CA 结合，但不与 PPP1CB 结合，这表明 C 末端而不是 N 末端决定了结合的特异性。不同 PPP1C 蛋白亚基的功能是近几年才开始被人们发现的。在细胞间期，所有的蛋白亚型都存在于细胞核和细胞质中，PPP1CC 和 PPP1CB 在核仁中累积35-37。在细胞质中，PPP1CA 蛋白通过 PPP1R15A/GADD38与内质相关联，通过 Bcl-239, 40与线粒体相关联。PPP1CC1 通过 URI141与线粒体相关联，通过肌动蛋白糖原磷酸化酶与肌浆相关联。PPP1C 不同的蛋白亚基在哺乳动物脑组织中的表达程度不同，PPP1CA 和 PPP1CC1 在数突棘的表达量
10、最明显 42。PPP1CB 基因在骨骼肌2和黏着斑中有表达3 ，而 PPPCC2 在睾丸和特定精子表达量较大43, 44。 PPP1C 结构随着细胞周期的变化而变化，在特定时期内结合不同的 PIPs 实现特异性功能45 。到目前为止，已经发现了 200 多个 PIPs 使酶在亚细胞，基底，组织特异性方面发挥作用25, 46。此外，一些 PIPs 在组织中也存在选择性剪接，使得 PPP1C 全酶的功能更加多种多样。例如，SARP 基因在人体内就存在着三种选择性剪接体，SARP1 蛋白普遍表达，而 SARP2 和 SARP3 分别只在睾丸和脑组织中表达47。第二篇 研究内容27西门塔尔牛 PPP1
11、CB 和 ACSL4 基因多态性研究.271.1 材料与方法271.2 结果351.3 讨论471.4 小结49第二章 PPP1CB 和 ACSL4 基因多态性与西门塔尔牛屠宰性状.502.1 材料与方法502.2 结果与分析512.3 讨论542.4 小结582.3 讨论人类基因组中 98%的序列为非编码序列90 ，而真核生物中的非编码序列也占据很大的一部分。然而由于这些序列不能够合成蛋白质，曾经一度被人们所忽视。近年来人们逐渐意识到这些序列的作用，这些序列不仅在编码蛋白的表达调控中起着重要的作用，而且也是生物进化研究的钥匙95, 96。基因组中的非编码序列，包括内含子、非转录的侧翼序列以及
12、非编码 RNA 的碱基序列。这些序列可以将蛋白质和 RNA 定位到细胞特定的位置，与其他序列一起调节基因的功能和控制编码蛋白的表达水平。此外，这些非编码 DNA 转录序列可能实现一些新分子功能，例如调控 RNAs。利用全基因组关联研究 GWAS）对人类基因组进行分析，已经发现上千个 DNA 的变异与几百种复杂性状如身高）和疾病如糖尿病）之间的关系，但是这种关系并不是因果关系，识别出这些变异与某些已知的疾病或性状的因果关系，以及弄清这些变异怎么作用影响生物体，是一项十分困难的事情。到目前为止，大多数的基因突变发生在非编码区，它们的功能影响仍然没有确定。根据 GWAS 的分析结果显示在非编码区序列
13、的调控单元，或者是在特定的细胞单元富集着很多突变位点，这些突变位点可能与一些性状相关，也可能与某些特定的疾病相关95。结 论本文采用 PCR-RFLP 的方法检测了中国西门塔尔牛 PPP1CB 和 ACSL4 基因的多态性，并将多态性位点与西门塔尔牛屠宰性状进行了分析，结果如下：1） 中国西门塔尔牛 PPP1CB 基因的内含子 1 第 14434 个碱基处存在 CT 的单碱基突变， PPP1CB 基因内含子 1 不同基因型与西门塔尔牛屠宰率存在显著相关 p0.05），CT 型的屠宰率显著高于 TT 型。其他性状在不同基因型间的差异不显著。2） 中国西门塔尔牛 ACSL4 基因的内含子 10 第 2327 个碱基处存在 GC 的单碱基突变，ACSL4 基因内含子 10 不同基因型与西门塔尔牛屠宰性状无显著相关性。
