1、质粒 pClSIRESProT 的构建及其体外表达上海第二医科大学ActaUmversitatisMedicirisSedaeShanghal【文章编号】02585898(2001)O3 019303质粒 pCISIRESProT 的构建及其体外表达周霞秋.王斌.谢青.俞红,臧国庆,廖丹,郭清(一 k 海第二医科大学瑞金医院传染科,上海 200025)【摘要】日曲探讨 DNA 痉苗 pcIS 一RESPro_r 口的掏建及体外表达方肚选择编码乙肝表面抗原 s基因片段,内核糖体进入位点 cinternalrImmentrysite,RES)片段和胸腺素原(prothymosin.PmT)基因片段
2、,利用基因重组技术掏建成 DNA 质粒 ISIRESPro,并将该 DNA 质粒转染成纤维细胞 ln 一结善不仅可通过 RTPeR 检测到其 R 的表达,而且 ELISA 也检测到其抗原表达: 结话构建的质粒可作为 I)NA 疫苗,进一步用于免疫动物:【关键词】DNA 疫苗;乙肝表面抗原;胸腺素原【中图分类号】O784;C86【文献标识码】ATileC_0nnlc60IlofPlasmidpCISIRESPmT.andIts/nV/troExp 答 si0IlZHOUXia-qiu,WANGBin,XIEQing,etal(Departmentofln)bctiousDisease,Ruiji
3、nHospital,SSMU,Shanghai200025,China)IAbstractObjectiveFoinvestigatetheconstructionnfDNAvaccinepClSIRESProTanditsinvitroexpressionMethodsTheDNAplasmldpCiSIRESPmrr,whichcomanedtheSgeneencodingsurfaceantigenofHBV,internalribcomeentrysiteandcytokneprothymosingene,-asconstructedhygenetechnokyTheplasmidpC
4、ISIRESPmTwastransferredintothecelllineNIHa3“3.TheinvitroexpressionofDNAplasmdwasobservedResultsTranscriptsoftheplasmidweredetectedbyRTPCR.andHBsAgwasaldetectedbyELISA.ConclusionTheplasmidpCiSIRESProTcanbeusedasaDNAvaccine.【KeywordsDNAracegelHBsAg;prothymosinDNA 疫苗作为一种新型的疫苗,因其具有广阔的应用前景.成为近年来研究的热点.本研究
5、通过构建共表达乙肝包膜小蛋白(HB4g) 和细胞因子胸腺素 n 原(prothymosinn,ProTo)的 DNA 疫苗口【 ,ISIRESPlot,观察其体外表达的情况 ,为进一步用于动物免疫作准备材料与方法质粒构建lpCIS 的构建 :以含 HBV 全序列基因的质粒f 作者简介】周霞祧(1937 一).女.浙江镶海人,教授.学士博士生导师f 基金项目】国家自然科学基金资助项目 f39770680)和上海市博士点摹叠资助项目(98,9g 年度)pHBV(aywl 型 ,北京医科大学斯崇文教授提供 )为模板设计引物,5引物 PI 为 5一 GTcGAcGccArr(CAGTGGAATTCC
6、一 3,3引物为 5一 ACCf 丝 4670 二了二 4(二 4(TGGAT 一 3 为便于连接,在上游引物设计 XhoI,下游引物设计KpnJ 限制酶切位点.PCR 扩增乙肝表面抗原的基因片段 s,将 PCR 产物测序鉴定正确后 ,KpnIXhoI 酶切 ,低熔点胶分离并纯化 s 片段,定向克隆人已行相应酶切(KpnI+XhoI)的真核表达载体pCI(上海血液研究所诸江博士提供)中,构成质粒pCIS2.质粒 pCISIRESPrOTo 的构建:将含IRES 的质粒 pGIP(美国宾州大学 Morgan 博士惠赠)用 ClaI 酶切,补平,再用 SalI 酶切,低熔点胶上海第二医科大学9“4
7、?AetaUnivetatisMedidmlisSe.d1daeShanghai分离并回收 IRES 片段,克隆人已行相应酶切(SlaaI+SalI)的 IS 中,构成 pCISIRES.无菌条件下取小鼠胸腺,液氮研磨,加 lmlTrizol,常规抽提组织中总 RNA 根据 genebank 查得的序列设计 ProTPCR 引物,上游引物 5TCGGGCCGTCCTCGAACTC(AcnTrTAA3.下游引物 5,rr(:GGCC(rAGG11cACGGT(.;CGTAAGG3为便于连接,分别在上游引物设计 ApaI 下游引物设计NotI 限制酶切位点,以胸腺组织总 RNA 为模板行RTPCR
8、(逆转录试剂盒为 Boeringer 产品)克隆ProT片段,将 RTPCR 产物测序鉴定正确后,行双酶切(ApaI+NotI)定向克隆人已行相应酶切(ApaI+NotI)的质粒载体 pClSIRES 中.构成 pClSIRESProT=(pclsIProT.).细胞转染和相关检测1.质粒的转染:将质粒 pCl,pClS,口 cIsIPr 及对照质粒 pcI 一 0Gal 转染细胞 NIH3T3(中国科学院细胞研究所提供),按照转染试剂 Lipofectamine(GibmBRL 公司提供 )说明操作.2RTPCR 分析外源基因的表达 :取转染 72h细胞,抽提细胞总 RNA.以 s 和 Pr
9、oTo 的引物作为引物,行 RTPCR 扩增 s 和 ProTo 片段,同时设立GAPDH 为内参照物,将 PCR 产物行凝胶电泳分析 .3.XGal 原位染色检测报告基因 LacZ 的表达:将转染 72h 后的细胞用含 Mg2 的 PBS 洗 2 遍,PBS 缓冲液福尔马林 4t2 固定 5rain,弃固定液,PBS洗 23 次,每孔加入 lmlXC,d 染液,37孵育过夜,显微镜下观察蓝染细胞.4 转染细胞及上请中 s 抗原的检测:取转染 72h后的细胞及上清,用单克隆抗体 ELISA 法检测 lIB 一,sAg 抗原,按照试剂盒(上海实业科华公司产品)说明操作结果pc 卜 S,poSIR
10、ESPr0T,的构建KpnI+xh0I 酶切鉴定 DCIs 正确,得到预期的 4kb 和 680bp 两个片段;ApaI+NotI 酶切鉴定 pClsIRESProTo,得到预期的 5296bp(pCISIRES)和 435bp 片段(ProT=)( 图 1).细胞转染的检测1RTPCR 产物:转染 pCI 的细胞样品只有内参照物片段;转染 pCIS 样品扩增出 s 和内参片段;转染 pClSIRESProT=的细胞样品扩增出S,ProTo 和内参片段 (图 2)2.LacZ 基因的表达: 蓝染细胞出现是因为 LacZ基因仅存在于原核细胞中,经转染进入真核细胞NIw 后,表达产生 B 一半乳糖
11、苷酶,后者作用于 xGaI 使之水解,细胞产生蓝色( 图 3).由此表明本实验选用的真核细胞启动子 pCI 可以在真核细胞起作用.围 1pc 卜 s,pcISIRFNI 酶切鉴定Hg1H 咖 f 帅 IIf 他由 c 帅帕 0fp0 一 s,iaclsIRKS;一1:PHYnmrker(Yakarar【y);2:【digledwithKpn;3:1471 一SdigestedwlKpnI+XhoI;4:pCIsIRESPmq=digettwl1hA 阳 I+tI;5:PCRprcx:lucts0rProL;6:pCIS IRFSdigwithNotI680bp435bp围 2RTPCR 检测F
12、ig2ProductsofRIlR1:I)L2(J【marker(Pakara);2:RTPCRproductsolProT=:3RT PcRf)nxAucbufPrL;F14:RTPCRproducnfpetsIRESPr.周霞秋等质粒 pcISIRESProTo 的构建及其体外表达囤 3xGal 厚位染色桂测报告基因 laeZ 的寰达3D【p 峭 si 帅 n 叩 0ngenel 朋 zdctecledIIyX3.转染细胞裂解液及转染上清的 H】g 检测:空质粒 pCl 不论在转染细胞上清液还是在裂解液中,均无 HBsAg 表达;vCIS,pCI SIRESPro-L 在裂解液和转染细胞上
13、清液均有明显的表达,但在上清液中的 OD 值高于转染细胞裂解液中的 OD值,这可能与 HBsAg 为分泌型蛋白有关(附表).附表转染细胞裂解液及转染上清的 IBsAg 幢刮OO 值TalaTiter0clmsAgIn 翱 per 瑚 antandt 瑚 nec.dcellstysate【C)vaLue)讨论DNA 免疫是一种新兴的免疫技术,直接将编码抗原蛋白的基因质粒注入动物组织,在该质粒所携带的强启动子的作用下表达相应的抗原蛋白,从而诱发机体产生针对该表达产物的免疫反应_3_.与诱导机体产生保护性抗体有关的抗原为 ms 舨,其编码基因为 s 基因,本实验选择该基因片段,构建 DNA疫苗.为增
14、强 DNA 疫苗免疫作用,将编码 ProT片段ProT克隆人质粒 pCIS2S.ProT是一个小的高度酸性蛋白,与胸腺素(L)同属于胸腺素 a 家族,其 N 端前 28 个氨基酸残基与完全一致.ProT具有多种生物学活性,其中包括有很强的免疫活性 l4J.大量实验证实,ProT在增强免疫及抗肿瘤活性方面具有多方位全面的效应,其免疫活性甚至比 1还高.为使 ProT与 S 基因在同一载体内高效表达,用内核糖体进入位点(IRES)基因片段将两者连接.通常在同一细胞中同时表达两个基因的做法为利用两个内启动子,但启动子之间的相互干扰会造成转录效率的不一致,影响两个基因的同时高效表达.最近研究发现通过微
15、小 RNA 病毒的内核糖体进入位点(IRES)连接构建的双顺反子载体,则不影响转录,同时翻译成多种蛋白质 71.本实验将乙肝病毒包膜中蛋白抗原基因克隆人巨细胞病毒即刻早期启动子/增强子下游,利用 IREs 片段连接病毒壳膜抗原基因与细胞因子 PmL 基因,构建了双顺反子DNA 质粒 pcISIRESProTo将构建的 DNA 质粒体外转染成纤维细胞NIHB-观察到它们既能在 RNA 水平表达,而且在细胞裂解液及转染细胞的上清液中还检测到明显的病毒抗原表达.表明本实验构建在 DNA 疫苗可进一步用于免疫动物.【参考文献】1DolmellyJJ.UlmerjB.LiuMAI1 日 twithDAJ
16、JImn1LLT1.1994,176:145152.2Gt4derM.TokgeKChltocc.etaLCellulardhumoraLiramu 叫 respontohepatitisBviruseturalproteinsinmiceafter】)NAbasedimmunization.JGstrcentroLcNy,1997.112:130713203Md3onnellWM.AskaJiFKDNAn.NEngLJMed.199633442454iCorderoOj.KrieglerAB,VerschoorSM.elaLTherelationshipbel,vlerldifferenth
17、ighproliferativepotentialcolon5.“-fomungcellinm0ub【megllrrowJlmmunolP-be,am1%-,y.1995.29:215 2275Ipez 儿 BrantbenS.CauclmtJF,et.aLDifferentialexprt.ssinn.fcytokinemRNAsinhumancelllinesjJLymphoklneCytoklneR,1994.13:1751846.Enm3ennanMFeminHM【 ;enwlthpnxnotersin.trovimsv.Lanbeindrpdentsupprodby】lepitenetinmechanimJCdL.1984,39:459467【7】(;hattsIR.】 鼯 jR,MajorsJEThe 哪.card1t!sviresin 一【nneeltryvirusinternalrilxmmeentrytealk】eftitcu0xprexing【twogenebmarecombinantprovimincu1.1uredeLIsandinembryj.vioLCellB_(1I.199111:584858 的【憧稿日期 l20001 埚一 l5
