1、DNA 测序技术的发展及其最新进展摘要：自从诺贝尔奖得主桑格于 1977 年发明了第一代 DN 测序技术以来，DNA 测序技术已经作为重要的实验技术广泛的应用于现代生物学研究当中。经过了几十年的发展，DNA测序技术日臻成熟，并且以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经诞生。本文主要就每一代测序技术原理和特点及其最新进展做简要介绍。关键词：DNA 测序技术；第三代 DNA 测序技术；最新进展The Development and New Progress of DNA Sequencing TechnologyAbstract: Since Nobel Prize Winner Sanger h
2、ave founded the first generation of DNA Sequence technology in 1977, DNA sequencing technology has been widely used in modern biological researches as an important experimental. Over decades of years development, DNA sequence technology mature gradually and the third generation sequencing technologi
3、es characterized by single-molecule sequencing have also emerged. The mechanisms and features of each generation of sequencing technology and their latest progress will be discussed here.Key Words: DNA Sequence technology ; third generation DNA sequencing ;latest development1.引言DNA 测序技术是分子生物学研究中最常用的
4、技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。自从 1953 年 Watson 和 Crick 发现 DNA 双螺旋结构后 1，人类就开始了对 DNA 序列的探索，在世界各地掀起了 DNA 测序技术的热潮。1977 年 Maxam 和 Gilbert 报道了通过化学降解测定 DNA 序列的方法 2。同一时期,Sanger 发明了双脱氧链终止法 3。20 世纪 90年代初出现的荧光自动测序技术将 DNA 测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代 DNA 测序技术。最近几年发展起来的第二代 DNA 测序技术则使得 DNA 测序进入了高通量、低成本的时代。目前,基于单分子读取技术的第三代测序技术已经
5、出现,该技术测定DNA 序列更快,并有望进一步降低测序成本,推进相关领域生物学研究。本文主要介绍 DNA测序技术的发展历史及不同发展阶段各种主要测序技术的特点，并针对目前新一代 DNA测序技术及目前国际 DNA 测序最新进展做简要综述。2.第一代测序技术早在 1954 年，Whitfeld 等就提出了测定多聚核糖核苷酸链的降解法 4，该方法利用磷酸单酯酶的脱磷酸作用和高碘酸盐的氧化作用从链末端逐一分离寡核糖核苷酸并测定其种类。但由于操作复杂等原因，该方法并没有被广泛应用。在 1977 年，Sanger 等提出了经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法 5。该方法的原理是：由于 ddNTP 的 2和 3
6、都不含羟基，在 DNA 合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此可以被用来中断 DNA 合成反应。在 4 个DNA 合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种 ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的 DNA 序列。同一年，Gilbert 等提出了化学降解法 6。该方法与 Sanger 法类似，都是先得到随机长度的 DNA 链，再通过电泳方法读出序列。二者的不同之处在于，Gilbert 法是先用特定的化学试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列，而 Sanger 法是通过 ddNTP 随机中断合成待测序列。此后，在 Sanger 法的基础上，80 年代中
7、期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪 7。另外，90 年代中期出现的毛细管电泳技术使得测序的通量大为提高 8。除此之外，这一时期还出现了一些其他的测序方法，如焦磷酸测序法 9、连接酶测序法 10 、杂交测序法 11等。其中焦磷酸测序法即为后来 Roche 公司 454 技术使用的测序方法，连接酶测序法即为后来 ABI 公司 SOLiD技术使用的测序方法。3.第二代测序技术 随着人类基因组计划的完成，人们开始进入后基因组时代。科学家逐步测出多种生物的序列，传统的测序技术已经无法满足高通量和高效率的大规模基因组测序， 。经过不断的
8、开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术 12,13、Illumina 公司Solexa技术 14-16和ABI公司的SOLiD技术 17,18为标志的第二代测序技术诞生了。与第一代技术相比，第二代测序技术不仅保持了高准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度。使用第一代Sanger 的测序技术完成的人类基因组计划，花费了 30亿美元巨资，用了三年的时间；然而，使用第二代SOLiD的测序技术，完成一个人的基因组测序现在只需要一周左右的时间。第二代测序技术实现了高通量、高效率、高准确度的测序大大降低了测序的成本，DNA测序可以向个人测序发展。第二代测序技术很好应用于单核
9、苷酸多态性（Single Nucleotide Polym -orphism， SNP）的研究，对探索人类的遗传及基因病有极大的意义 19。4第三代测序技术近期出现的 Helicos 公司的 Heliscope 单分子测序仪、Pacific Biosciences 公司的 SMRT技术和 Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序。其中，Heliscope 技术和 SMRT 技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。现介绍如下：（1）单分子
10、即时 DNA 测序：简称 SMRT，是在 4 种 dNTP 的 1 一磷酸上标记有不同发射光谱的荧光基团，当 DNA 聚合酶催化 dNTP 掺入到合成链中时，使用显微镜可以检测到每个掺入 dNTP 所携带的荧光信号，经计算机分析转化为相应的碱基序列信息。这种荧光标记的 dNTP 不会影响 DNA 聚合酶的活性，并且在掺入合成链后其荧光基团与 y-磷酸解离，合成的 DNA 链和天然的 DNA 链完全一样 20。在显微镜即时记录 DNA 链上的荧光的时候，DNA 链周围的众多游离的荧光标记 dNTP 形成了非常强大的荧光背景。单分子的荧光探测由一种被称为零级波导(zero mode wave gu
11、ide)的纳米结构来实现 DNA 聚合的即时观察和背景荧光干扰的消除 32。该结构在一片薄金属膜上蚀刻出数以千计直径数十纳米的小孔，并将金属膜附着在透明的支持基质上，由于每个小孔的尺寸低于光的波长，所以当光线从透明的基质侧照射时无法透过小孔，而是在小孔底部形成指数衰减的消逝波，这样创造了一个很小体积的检测空间(zeptoliters，即 10。21L)。在这么小的孔内，DNA 链周围游离的荧光标记 dNTP 有限，而且由于 4 种荧光标记 dNTP 非常快速进出于小孔，它们形成的是非常稳定的背景荧光信号。在每个小孔底部固定有一个 DNA 聚合酶分子，当某一种荧光标记 dNTP 被掺入到 DNA
12、 合成链时，其携带的特定荧光会持续一小段时间 (荧光光曝)，直到荧光基团被 DNA 聚合酶切除为止。荧光光曝的荧光颜色揭示了模板上的互补碱基，通过即时监控每个波导孔的荧光光曝，就能连续测定每一个孔内 DNA 模板的序列，序列读取速度可达到每秒钟十个碱基，能在短短的几分钟内对长片段 DNA 进行测序。从样本制备到测序完成，所需的时间还不到一天，这对于传染病监控和分子病理学尤为重要。（2）HeliScope 单分子测序：HeliScope 单分子测序技术仍然基于合成测序原理 21，它采用了一种新的荧光类似物和更加灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了第二代测序必须用 PCR 扩增
13、出数千个拷贝以增加信号亮度的缺陷。先将 DNA 文库的单链片段密集固定排列在平面基板上形成阵列，在每个测序循环中，DNA 聚合酶和一种荧光标记 dNTP 流人，按照模板序列延伸 DNA 链，阵列中发生了碱基延伸反应的 DNA 链就会发出荧光，通过 CCD 记录并转化为相应的碱基序列信息。经过洗涤，延伸了的 DNA链上的荧光物质被切除并被移走，便可以进行下一轮单个碱基的延伸、荧光标记的切除以及图像的获取。HeliScope 利用精密的全内反射显微镜技术降低荧光背景的同时，在测序结束后去掉延伸的合成链，将模板重置为最初的单链状态，从相反的方向再进行另一次测序，生成同一模板的第二个序列信息，重复的双
14、向测序可以用于去除缺失错误，显著提高了原始数据准确度。利用 HeliScope 技术，Harris 等 22对 M13 病毒全基因组分割而成的 280000条 DNA 链进行了同步测序和双向测序，并标记出所有的单碱基突变类型。HeliScope 技术中每条合成链都是独立操作的，但亦面 l 临着同聚核苷酸的误读问题，只能寄希望于通过动力学控制 DNA 聚合酶活性，降低 DNA 链延伸的速度。在 dNTP 被洗掉前减少两个连续碱基连接在链上的可能。（3）基于荧光共振能量转移的即时 DNA 测序：基于荧光共振能量转移(FRET)的测序技术是在 DNA 聚合酶上标记有荧光供体，在不同的 dNTP 上标
15、记不同发射光谱的荧光受体，当掺人合成链时 dNTP 与 DNA 聚合酶位置靠近而发生荧光共振能量转移，能量从聚合酶的荧光供体转移到 dNTP 的荧光受体，供体的荧光强度降低，受体的荧光强度升高，捕捉到的荧光信号被转化为相应的碱基序列信息 23。此法被认为是 HeliScope 技术的改进，具有两大优势：首先，游离的 dNTP 不发光，只有其掺入到新合成的 DNA 链时才会发光，极大地降低了背景荧光干扰；其次，因为用 FRET 方法不需要用到持续的高能量的激发光照射，因此也能够极大地减少 DNA 聚合酶的光损伤作用，进一步延长了测序长度。（4）纳米孔单分子测序：Stoddart 等 24在一个由
16、生物分子 (如 溶血素蛋白)组成的纳米孔内侧分别结合了一个核酸外切酶和一个环式糊精分子，并将其置于一个类似细胞膜结构的脂质双分子层中。当 DNA 模板进入纳米孔时，孔中的核酸外切酶会“抓住”DNA 分子，逐个剪切掉 DNA 分子的组成碱基，被切掉的单个碱基通过纳米孔时都会与环式糊精分子相互作用，产生一个特异性电流，根据这个电流就能推测出是哪一种碱基通过了纳米孔。每种碱基在通过纳米孔时引起的特异性电流均不同，很容易区分出不同的碱基信号并转化成 DNA 序列信息。纳米孔测序的优势在于它不需要对 DNA 进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和 CCD 照相机。目前的甲基化研究都需利用重亚硫酸盐处理，将
17、非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，使其在后续分析中与甲基化胞嘧啶区分开来。纳米孔技术的另一优势就是能利用特异性电流的微小差异直接读出 DNA 序列中的甲基化胞嘧啶，不再需要重亚硫酸盐转化，对表观基因组测序的研究人员来说意义非凡。新近，Derrington 等 25列利用耻垢分枝杆菌孔蛋白 A 构建了一种纳米孔，其特点是可以将单链 DNA 的局部双链结构松解，使其顺利通过纳米孔，保证测序过程更加通畅。但是，纳米孔测序仪仍面临两个重要的技术问题：一是如何将核酸外切酶更好地附着在孔上，确保每次只有一个碱基通过纳米孔，另一个是并行化问题，可能需要开发芯片来确保整个测序过程更快速。（5）离子流半导体测序：离子
18、流半导体测序技术使用了一种高密度半导体芯片，芯片上布满了小孔，这些小孔就是一个个的测序反应池，其内侧固定了一个 DNA 聚合酶分子。小孔底部附有能感应 pH 变化的离子敏感层和离子感受器，当 DNA 聚合酶在每一个 DNA 模板链上滑动，合成链中每掺入一个核苷酸，离子敏感层和离子感受器就会检测到释放出的氢离子引起的 pH 值变化，并将其转化为电信号，进一步翻译为对应的碱基，因此该技术被戏称为“测序的 pH 计” 。与纳米孔技术一样，离子流半导体测序技术也同样不需要标记核苷酸和昂贵的光学探测设备。不久前问世的 Ion TorrentPersonal Genome Machine(PGM)测序仪只
19、有微波炉大小，可以在 I2 h 内完成 100200 个碱基的测序任务。5.DNA 测序技术最新进展自从 DNA 测序技术诞生以来，就以迅猛的速度向前发展，并大大推动了生命科学的研究进展。快速的 DNA 测序有可能很快成为每个人医疗记录的例行工作的一部分，揭示出过去隐藏在人类基因组 30 亿个核苷酸碱基中的庞大的信息。来自美国亚利桑纳州立大学生物设计学院单分子生物物理中心的主任 Stuart Lindsay 刚刚成功地解决了新型纳米孔测序法中的一个主要的绊脚石 26。Lindsay 最新的实验结果证实了其在 DNA 读值方面取得重大的改进，这一论文发布在纳米技术杂志上。根据 Science 综
20、述当前的技术状况，纳米孔测序“似乎准备离开实验室” ，并且一个基因组 1000 美元测序成本的梦想有可能近在咫尺，虽然仍然存在一些障碍。据物理学家组织网 12 月 12 日（北京时间）报道，英国研究人员简化了基因组测序的标准流程，首次无需进行文库制备便完成了 DNA 单分子测序，而且新方法只要很少量的DNA 就能获得序列数据，用量可低至不到 1 纳克，仅为常规测序方法的 500 分之一到 600分之一。该研究论文的第一作者、英国威康信托基金会桑格研究所的保罗库普兰说：“我们用这种方法对病毒和细菌的基因组测序后发现，即使在相对较低的水平，我们也能够确定所检测的是何种有机物，不论样本中是否存在特定
21、的基因或质粒（这对于确定抗生素耐药性很重要） ，或者其他信息，如对特定 DNA 碱基的修改等。 ”他表示，一旦技术得到优化，将在快速、高效地识别医院和其他医疗场所中的细菌和病毒方面具有很大的应用潜力。这项技术也使得科学家能够对此前无法识别的宏基因组（也称微生物环境基因组）样本中的生物体进行确认。 “为微生物测序，首先需要能够在实验室中培养它们。 ”论文的主要作者、英国巴布拉汉研究所的塔米尔钱德拉说， “这不仅耗费时间，而且有时候微生物不生长，为它们的基因组测序极其困难。 ”他表示，新方法可以直接对微生物测序，短时间内便可确定其身份。论文的另一主要作者、威康信托基金会桑格研究所的哈罗德斯维尔德洛
22、说：“我们的技术可以在对所测序列没有任何先验知识、没有特定微生物试剂的条件下，在很短的时间内操作，这是一种很有前途的替代手段，可应用于控制感染等临床需要。 ”这项技术也使得科学家能够对此前无法识别的宏基因组（也称微生物环境基因组）样本中的生物体进行确认。因而我们说，英国科学家此番取得的突破，不管是从整个学科研究的方法论层面，还是从临床应用的角度，都提高了基因研究服务于人类的速度 27。6.结语DNA 测序技术作为一项重要的技术早已成为生命科学研究的基础支撑技术，广泛的应用于生物学及医学研究。随着科技的发展，相信未来会有更为高效、便捷的 DNA 测序新技术诞生，DNA 测序技术也将会好的应用于造
23、福人类。1 Watson J.D., Crick F.H.C. A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature.1953, 171:737-738. 2 Maxam AM , Gilbert W . A new method for sequencing DNA. Proc Natl Acad Sci USA , 1977 , 74(2) :560-564.3 Sanger F ,Nicklen S, Coulson AR . DNA sequencing with chain -terminating inhibitors . Proc Na
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