1、1实验一 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳实验目的(1)了解电泳的一般原理、撑握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术。(2)测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。实验原理带电荷的胶体粒子在电场中移动的现象称为电泳。醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持物。血清中含多种蛋白质,当在 pH 这 8.6 时,这些蛋白质均带负电,它们在电场中向阳极移动,由于各种蛋白质所带负电荷多少及颗粒大少不同,所以在同一电场,同一 pH 环境中泳动速度不同。本实验以醋酸纤维素为电泳支持物,分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白, -球蛋白、 -球蛋白、 -球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氢基酸组分、立体构象、分子量、等电
2、点及形状不同(表 17.1) ,在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性 pH 缓冲体系中、带负电荷表 2 人血清中 12 种蛋白质的等电点及分子量蛋白质名称 等电点(pI) 分 子 量清蛋白-球蛋白-球蛋白-球蛋白4.885.065.126.85-7.50690001200000230000090000150000156000300000多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如,以醋酸纤维素薄膜为支持物,正常人血清中 pH8.6 的缓冲体系中电泳 1h 左右,染色后可显示 5 条区带。清蛋白泳动最快,其余依次为 1-, 2-, -及 -球蛋白(如图 17.1) 。这些区带经洗脱后可
3、用分光光度法定量,也可直接进行光吸收扫措自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。此法由于操作简单,快速。目前,已成为临床生化检验的常规操作之一。临床意义清蛋白 62-72% 1球蛋白 3-4% 2球蛋白 6-10% - 球蛋白 7-11% -9-18%血清蛋白电泳的病理改变多半是清蛋白隆低和一种或二种以上球蛋白增加,其临床意义表 3 血清蛋质的临床意义球蛋白清蛋白1 2 附 注妊 娠 中毒时更明显,产后 2-3 个月正常婴 儿 6 个月时 正常,其它成分 6-10 岁时正常多发性骨髓瘤 异常球蛋白,可在 和 区带间出现 M 区带2糖尿病 肝硬变
4、在晚期失代偿时阻塞性黄疸 无丙种球蛋白血症 全身性红斑狼疮 类风湿性关节炎 风湿热 淀粉样变性 肾病 试剂1.巴比妥缓冲液(pH8.6 离子强度为 0.06):称取巴比妥纳 12.76 克,巴比妥 1.66 克,置于盛有200ml 蒸馏水的烧杯中稍加热溶解后,移置 100ml 容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度。2.染色液:氨基黑 10B.5 克,加甲醇 50ml,冰乙酸 50ml,蒸馏水 40ml,溶后备用。3.漂洗液:甲醇或乙醇 45ml,加冰乙酸 5ml,混匀即可。4.洗脱液:0.4MNaOH5.透时度:冰乙酸 25ml,加 95%乙醇 75ml 混匀。操作1.准备点样:将薄膜条(82cm)浸
5、入巴比妥缓冲液,再于薄膜的无光泽面的一端 1.5cm 处,用毛细管或玻片取血清呈直线状滴加,等渗入膜内后,将薄膜有样品的一面向下(以防蒸发干)贴在电泳槽架上,两端用浸湿的滤纸作桥贴紧。盖严,平衡 5 分钟。2.通电:一般电压为 120-140V,电流约(0.4-0.6mA/cm )通电 45-60 分钟,待电泳区带展开约25-35mm 后关闭电源。3.染色:通电完毕,将薄膜直接浸于染色液中:2-3 分钟后取出,用漂洗液清洗数次,脱色至背景为无色。4.定量:将漂洗净的薄膜吸干,剪下各个蛋白色带,同时按各区带的平均宽度剪下一条空白区带,然后分别浸入 0.4MNaOH5ml 的试管中,振摇数次,使色
6、泽浸出。于 50-620 毫微米波长处比色,以空白带浸出液调整零点,测各部分光密度为:A 、 1、 2、 ,按下列方法计算:光密度总和 T= A+1+2+各部分蛋白质百分含量为:清蛋白(%)= 0TA1 球蛋白(%)= %12 球蛋白(%)= 02T球蛋白(% ) = 1球蛋白(%)= 05.透明:待薄膜完全干燥后,浸入透时液约 5-10 分钟,取出平贴在玻璃板上,完全干燥后即成3透明的膜,可于光密度计上测定密度,或作标本永远保存。结果分析:作业与思考根据人血清中血清蛋白各组分等电点,如何估计它们在 pH=8.6 的巴比妥缓冲液中移动的相对位置?实验二 ALT 测定标准曲线的制作实验目的了解标
7、准曲线制作的基本过程及使用标准曲线的意义。波长及在光电地色中滤光法的选择(nm) 滤光片颜色 测定介质颜色400435435480480490490500500560560580580595595610610750青紫蓝蓝绿绿蓝绿绿黄黄桔红红黄绿黄桔红红紫蓝紫蓝蓝绿绿蓝ALT 测定实验原理及标准曲线制作血清中 ALT 在一定的反应条件下,作用于丙氨酸及 酮戊二酸生成一定量的丙酮酸及谷氨酸。2,4 一二硝基苯肼能与反应产生的丙酮酸及剩余的基质 酮戊二酸生成相应的 2,4 一二硝基苯腙,后者在碱性条件下呈棕色。以相同克分子浓度计算,丙酮酸所形成的苯腙在 505 波长下的 OD 值为 酮戊二酸的三倍
8、,根据此特点可计算出 ALT 作用反生成的丙酮酸的量,从而推算出酶的活力。其反应式如下:丙氨酸+ -酮戊二酸 丙酮酸+谷氨酸丙酮酸+2,4二硝基苯肼 丙酮酸 2,4- 二硝基苯腙+水试剂1.基质液(含适量防腐剂)2.2,4二硝基苯肼溶液(1mmol/L )3.NaOH 溶液(4M )使用前用蒸馏水释 10 倍成 0.4MNaOH 溶液4.丙酮酸标准液(2mol/L)操作方法标准曲线的制作1.按表 5 于各管中加入相应试剂表 50 1 2 3 4pH7.4 磷酸缓冲液丙酮酸标准液(ml)基质液(ml)0.100.500.10.050.450.10.100.400.10.150.350.10.20
9、0.304相当于酶活力单位(卡门氏单位) _ 28 57 97 1502.在每一管中各加入 2,4 一硝基苯肼溶液 0.5ml 混匀,于 37。 C 水浴放置 20 分钟后加入0.4MNaOH 溶液 5.0ml 再混匀。3.室温放置 10 分钟后,于 505nm 波长比色,以 0 号管调零点,读取各管的吸光度,分别用各管的吸光度值与对应的卡门氏酶活力单位作图,即成标准曲线。血清 ALT 酶活力的测定(赖氏法)实验目的掌握分光光度计的正确使用方法,了解使用标谁曲线的竟义。实验原理同 ALT 标准曲线制作实验操作取试管 2 支按表 6 操作表 6空白管 测定管血清( ml)蒸馏水或生理盐水(ml)
10、基质液( ml)-0.10.50.1-0.53.将各管分别混匀,置 37。 C 水浴中 30 分钟后各加入 2,4 一二硝基苯肼溶液 0.5ml 混匀。4.再置 37。 C 水浴中 20 分钟,然后各加入 0.4MNaOH 溶液 5.0ml 再混匀。5.室温放置 10 分钟后比色,波长为 505mm,以空白管调零点,读取测定管的吸光度。6.计算:以测定管的吸光度,从标准曲线上查出相应的酶活力单位。四、正常值:5-25 赖氏单位实验三 纸层析分离、鉴定氨基酸实验目的掌握低层析的基本技术,了解分配层析在科研等方面的使用价值。实验原理将各种氨基酸点在滤纸一端,使层析剂经过点样处,各种氨基酸迁移率不同
11、,经过一段时间后,逐渐在滤纸上集中在不同位置通过测定各种氨基酸的 Rf 值,与标准对照,即可知该成分,其中 Rf=原 点 与 溶 剂 前 缘 间 距 离之 间 的 距 离展 层 后 斑 点 中 心 与 原 点在分离样品组分时,还会遇到单向展层分离不好的情况,此时可采用双向展层。即第一相展层后,除去纸上的溶剂,将滤纸干燥,沿溶剂前沿裁去没有扩展到的部分,转动 90 度后再用第二相溶剂展层。实验操作1取一张剪好的滤纸(勿用手摸) 。2分别用毛细管吸取各氨基酸溶液点在各处点样处(斑点直径不得超过 0.5cm) ,边点边用吹风5机吹干,反复 3 次。3取层析剂 100ml 于标本缸底,将滤纸悬于标本缸
12、层析液中,点样端朝下(点样处不得浸入层析剂中) ,上端滤纸两解用线固定,并盖好盖子,以防滤纸受潮变软,堕入层析剂中。4层析剂展层至上端约 1cm 时停止,取出标本,用铅笔标出层析剂前沿,用吹风机吹干再将茚三酮均匀喷在滤纸上并吹干。5标出各斑点的中心点,用尺量出点样处至溶剂前沿以及至斑点中心的距离。6计算 Rf 值。7根据各已知氨基酸的 Rf 值 ,确定混合标本中各氨基酸的成分。8结果分析。实验四 核酸的提取和鉴定实验目的通过此实验要求掌握成分分离的一般原理,并熟练掌握离心机的使用。实验原理核酸是生物大分子,根据其分子中所含戊糖不同而分为 DNA 和 RNA 两大类。根据 RNA 能溶于 0.1
13、4MNacl 溶液中,而将 RNA 与其它物质分开,又根据 DNA 能溶于 1M NaCl 溶液中,而将DNA 与其它物质分开。在加入蛋白质变性沉淀剂氯仿 异丙醇后,经离心可分成三层,上层为DNA 或 RNA 溶液,中层为蛋白质凝胶,下层为氯仿。所得 DNA、RNA 溶液分别用 H2SO4 在沸水中水解,可得其各种化学成份,再根据各化学成分特性分别予以鉴定。试剂10.14M NaCl。21 M NaCl。3氯仿异丙醇。495% 乙醇。55%H 2SO4。63.5 二羟甲苯:称取 3.5 二羟甲苯 1.5 克,加入浓盐酸 500ml,再加入 10%氯化高铁 2030滴,贮于冰箱。此试剂应在临用前
14、配制。7二苯胺:称取 1.5 克二苯胺,溶于 100ml 冰醋酸(A 、R )中,再加入浓 H2SO41.5ml 摇匀贮在棕色瓶中放冰箱内保存。85% HgNO 3。9浓氨水。10钼酸铵:称取相酸铵 5 克溶于 100 ml 蒸馏水中,再加入浓 H2SO415ml 待冷却后加蒸馏水1000ml。此试剂可于冷处保存一月不变 质。11氯化亚锡:实验操作(一)分离提取6取肝组织 3 克,研磨成匀浆,加入 0.14M NaCl 5ml,充分混匀,3500r/min,离心 10后分成两部分:(二)鉴定1嘌呤碱鉴定:嘌呤碱在碱性条件下可与硝酸银作用生成白色沉淀。表 141 2水解液(滴) 20 -5%H2
15、SO4(滴) - 20浓氨水(滴) 3 3结果判断结果分析:2磷酸鉴定:H3PO4+12 H2M0O4H 3PO412M0O3+12H2O磷酸 钼酸 磷钼酸H2PO412M0O3 H3PO46M0O33M02O5 还 原 剂钼蓝表 151 2水解液(滴) 10 -5%H2SO4(滴) - 10钼酸铵(滴) 5 5氯化亚锡(滴) 3 3结果判断7结果分析:3核糖鉴定:核糖 糠醛 绿色化合物 二 羟 甲 苯5.3表 161 2水解液(滴) 4 -5%H2SO4(滴) - 43.5=羟甲苯(滴) 6 6结果判断结果分析:4脱氧核糖鉴定:脱氧核糖 w-羟基 -酮基戊醛 蓝色化合物 二 苯 胺表 171
16、 2水解液(滴) 20 -5%H2SO4(滴) - 20二苯胺(滴) 30 30结果判断结果分析:实验五 酶促反应动力学实验实验原理唾液淀粉酶能将淀粉水解,生成各种糊精,最后可生成麦芽糖。淀粉与碘反应呈兰色,糊精根据分子大小,与碘反应呈兰紫、红等不等颜色。麦芽糖不与碘呈色。根据以上特征,可用来判断淀粉水解的进程,并判断在不同条件下(温度、pH 、激动剂、抑制剂)对酶活性的影响。试剂10.5%淀粉液(不含 cl) 。20.5%含 cl 淀粉液:每 100ml 淀粉溶液中加 Nac10.3 克。3pH6.8 磷酸缓冲液:1/15M Na2HPO449.6ml 加入 1/15M KH2PO450.4
17、ml 混匀即可。42%在碘液。5pH5.0 磷酸缓冲液:0.2M Na2HPO4 在 pH 计下以 0.2MHcl 调节至 pH5.0。6pH8.0 磷酸缓冲液:1/15M Na2HPO494.7ml 加入 1/15MKH2PO45.3ml。71%Na 2SO4 溶液。81%CuSO 4 溶液。实验操作温度对唾液淀粉酶活性的影响1收集唾液、并用蒸馏水稀释 5001000 倍(依个人的酶活性而定) 。2取试管 2 支,各加稀释唾液 5ml,一管直接加热煮沸,另一管置冰水浴中预冷 5 分钟。强酸3H2O强酸N2O83另取试管 4 只,编号,按下表操作。表 18管号步骤 1 2 3 4pH6.8 缓
18、冲液 1ml 1ml 1ml 1ml0.5%含 cl 淀粉液 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml置于冰水浴 5 分钟 置于 37水浴 5 分钟稀释唾液 预冷唾液各加 2ml 室温唾液 2ml 煮沸唾液 2ml摇匀仍置冰浴 10 分钟 摇匀仍置 37水浴 10 分钟碘 液 2 滴 移置 37水浴 10分钟后加碘液 2 滴 2 滴结 果结果分析:pH 对唾液淀粉酶活性的影响 取试管 3 支编号按下表操作:管号步骤 1 2 3磷酸缓冲液 pH5.01mL pH6.81mL pH8.01mL0.5%含 cL 淀粉液 0.5mL 0.5mL 0.5mL稀释唾液 2 mL 2 mL 2 mL保
19、 温 均置于 37水浴保温 10 分钟碘 液 2 滴 2 滴 2 滴结 果结果分析:激动剂、抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响取试管 5 支、编号按下表操表:管号步骤 1 2 3 4 5pH6.8 缓冲液 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml0.5%含 cL 淀粉液 0.5ml 0.5ml 0.5ml0.5%不含 cL 淀粉液 0.5ml 0.5ml1%Na2SO4 2 滴 2 滴2%CuSO4 2 滴稀释唾液 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml保 温 均置于 37水浴 10 分钟碘 液 2 滴 2 滴 2 滴 2 滴 2 滴结 果结果分析:9实验六 动物肝糖元的提取和鉴定实验目的通过实验要求
20、掌握糖代谢的相关理论,并在科研技能方面得到一定的培养。实验原理用三氯醋酸破坏肝组织的酶并沉淀蛋白质而保留糖元,糖元不溶于乙醇而溶于热水。糖元溶液呈现乳样光泽,遇碘呈红棕色,本身无还原性,在酸性溶液中加热可水解为具有还原性的葡萄糖,后者可将碱性铜溶液(班氏试剂)中二价铜还原为氧化亚铜。利用上述性质,可测定组织中糖元的存在。试剂(1)5%三氯醋液。(2)95% 乙醇。(3)0.9%NaCl。(4)浓盐酸。(5)50% NaOH 。(6)碘试剂:称取碘 100mg 和碘化钾 200mg 溶于 30ml 蒸馏水中。(7)班氏试剂:称取柠檬酸钠 173g 和碳酸钠 100g 溶于蒸馏水 700ml 中,
21、加热促溶,冷却后,慢 慢倾入 17.3%硫酸铜 100ml 边加边摇,再加蒸馏水至 1000ml 混匀,如混浊可过滤,取滤液,此试剂可长期呆存。实验操作1取饱食、饥饿小白鼠各一只迅速处死小白鼠,立即取出肝脏,用 0.9%NaCl 洗去附着的血液,并用滤纸吸干。2分别将肝组织迅速剪碎并放入盛有 5%三氯醋酸 2ml 的研钵中,将组织研磨至糜状,再加 5%三氯醋酸 1ml 于肝组织中,混匀后将肝匀浆倾入离心管中。再加 1m15%三氯醋酸清洗研钵,洗液也倾入离心管中,然后离心 3000 转/分,5 分钟。3取上清液,加入 95%乙醇 3ml、混匀,静置 10 分钟,3000 转/分离心 5 分钟,倾去上清液,可见:( 饥饿: 饱食: )4分别加蒸馏水 3ml 于上述沉淀管中,加热使沉淀溶解,可见( 饥饿: 饱食: )5分别取上管溶液 2 滴于白磁凹盘中,加入碘试剂一滴,观察其颜色。( 饥饿: 饱食: )6在上管溶液中,各加入浓盐酸 10 滴,置于沸水浴中 10 分钟,取出冷却,用 50%氢氧化钠0.5ml 中和。7分别将上管加入班氏试剂 2ml 煮沸 12 分钟,观察并记录所见。( 饥饿: 饱食: )结果分析: