1、腹主动脉缩窄型高血压大鼠心肌肌浆网钙泵活力的测定?418?临床医学?皖南医学院(JofWannanMedicalUniversity)2009;28(文章编号:10020217(2009)06 041803腹主动脉缩窄型高血压大鼠心肌肌浆网钙泵活力的测定王俊,何世保,汪念东,王安才(皖南医学院附属弋矶山医院老年医学内科,安徽芜湖 241001)Determinationoftheactivityofsarco-endo?-plasmicreticulumCa 一 ATPaseinratswithmyocardialhypertrophyinducedbyabdomi-nalaorticcons
2、trictionWANGJun,船bao.WANGNian dong,WANGAncaiDepartmentofGerontology.,YijishanHospital,WannanMedicalUniversity,Wuhu241001,China【AbstractObjective:TodeterminetheactivityofmyocardialsarcoendoplasmicreticulumCa“-ATP(SERCA)inratswithcardiachypertrophyinducedbyovedoadedpressure.Methods:Myocardialhypertrop
3、hywasinducedbyabdominalaorticconstriction(AAC)in20adultSprague,Dawleyrats,andtheratswererandomizedintogroupsofshamopera-tionandAAC(n=10each).Themeasurementwaspreformedregardingsystolicbloodpressure,heartweight(HW),bodywcight(BW),leftventricularweight(LVW)andleftventficularweightindex(IVw/BW,LVW11.Th
4、eactivityofmyocardialSERCAwasdeterminedbynonpolarphosphatemethod.Ca“concentrationincardiomyoeyteswasdetectedbydualwavespectrofluorometer.Results:Comparedwithshamgroup,systolicbloodpressureandLVWIinAACgroupweresignificantlyincreased(P0.01).TheactivityofmyocardialSERCAinAACgroupwassignif-icantlylowert
5、hanthatinshamgroup(P0.01),andCaconeentra 一收稿日期:2009-08-31作者简介:王俊(1973 一), 女 ,安徽宁国人,主治医师,(电话)13955370191,(电子信箱)whzhshj126.coin;王安才 ,男,博士,教授,主任医师,硕士生导师,通讯作者.tionofcardiomyocytesinAACgroupwasmarkedlyhigherthanthatinshamgroup(P0.O1)Conclusion:ThedropofmyocardialSERCAactivitymightbeinvolvedinmyocardialhy
6、pertrophyinratswithpressureoverloadinducedbyabdominalaorticconstriction.【Keywords】 abdominalaorticconstriction;hypertension;leftventrieularhypeflrophy;sarco/endoplasmicreticulumCa“?ATPase;rats【摘要】目的:观察腹主动脉缩窄型高血压大鼠心肌肌浆网钙泵活力.方法:2O 只雄性 SD 大鼠随机分为 2 组(每组10 只):假手术组和腹主动脉缩窄高血压组.鼠尾容积法测定术前 1 周和术后 2 周及 4 周的血压变
7、化.4 周后处死大鼠,测定大鼠心脏重量,左室重量和左室重量指数;无机磷酸根法测定心肌肌浆网钙泵活力,双波长荧光分光光度计检测心肌细胞内钙离子浓度.结果:腹主动脉缩窄型高血压组收缩压和左室重量指数明显高于假手术组(P0.01);与假手术组比较,腹主动脉缩窄型高血压组心肌细胞内钙离子浓度明显升高(P0.01),心肌肌浆网钙泵活力显着降低(P0.01).结论 :心肌肌浆网钙泵活力下降,心肌细胞钙离子浓度升高可能参与了缩窄升主动脉引起压力超负荷所致大鼠的心肌肥厚.【关键词】腹主动脉缩窄;高血压;左室肥厚;肌浆网钙泵活力;大鼠【中图号】R544.1【文献标识码】A心肌肥厚是心血管疾病的主要危险因素之一.
8、心肌肥厚不仅是细胞体积的增大,还涉及心肌细胞内游离钙浓度,细胞离子通道,离子流,膜电位及心肌肌浆网钙泵活力的变化,这些病理过程常可诱发【参考文献】1中华医学会儿科学分会呼吸学组,中华儿科学杂志编辑委员会.儿童支气管哮喘防治常规(试行)J.中华儿科杂志,2004,42(2):100106.2余传霖,叶天星 ,陆德源,等.现代医学免疫学M.第 1 版.上海医科大学出版社,1998:830831,l081.3向莉,胡仪吉 .咳嗽变异性哮喘的诊治J.实用儿科 I 临床杂志,2003,18(10):7767784王曼芝,何庆南 ,袁红霞,等.IL 一 4,IL 一 5 及 IgE 在咳嗽变异性567哮喘
9、中的价值J.中国当代儿科杂志,2006,8(5):382384.张霞,王玲,薛玉文,等.咳嗽变异性哮喘病人血中细胞因子表达的临床观察J.人民军医,2006,49(12):7476.周永列,邱莲女,应奇峰,等.哮喘患者自细胞表面分化抗原 23的表达与 IgE 的相关性研究 J.中国检验医学杂志,2001,24(5):293295王淑珍,龚向芳.咳嗽变异性哮喘病人行支气管激发试验前后血清 IgE 变化 J.中国航天医学杂志,2003,5(1):3738.皖南医学院(JofWannanMedicalUniversity)2009;28(6心律失常甚至导致猝死.本研究采用腹主动脉缩窄术建立压力超负荷心
10、肌肥厚动物模型,探讨心肌肥厚与肥厚心肌细胞钙离子浓度及肌浆网钙泵活力变化的关系.1 材料与方法1.1 腹主动脉缩窄型高血压大鼠模型的建立和分组1.1.1 分组健康雄性 SpragueDawley 大鼠 20 只体重(22020)g,购自河南大学实验动物中心,随机分成 2 组(每组 l0 只):假手术组(Sham 组) 和腹主动脉缩窄型高血压组(AAC 组).1.1.2 腹主动脉缩术大鼠用 10%水合氯醛麻醉后,沿左侧肋缘下作一长约 2cnl 的斜行切口,暴露左肾,在肾动脉上方分离一小段腹主动脉,将头部磨钝的 7 号针连同腹主动脉一并结扎,立即抽出针头,造成腹主动脉的缩窄.术后连续 3d 肌注青
11、霉素钠(8 万单位 /100g 体重). 假手术组动物在分离一小段腹主动脉后,穿过手术缝线不作缩窄.关闭手术切口.1.2 血压的测定采用鼠尾容积法测量大鼠的尾动脉收缩压,分别在购人大鼠后术前,术后 2 周和 4周测量一次血压,每只鼠连续测量收缩压 3 次,间隔60S,取其平均值 .1.3 心肌标本制备1.3.1 大鼠处死后,立即开胸摘取心脏,沿房室环剪去心房及右室游离壁,称取余下的室问隔,左室游离壁作为左心室重量(LVw), 计算左心室重量指数(LVwI),即为左心室重量(LVw)/大鼠体重(BW)比值(mag).1.3.2 同时称取左心室游离壁心肌组织 100mg 入液氮速冻,置于一 80冰
12、箱冻存,用于肌浆网钙泵检测.另外将剪下的新鲜心肌组织迅速用冰冷生理盐水冲洗血液后放入冰冷的 HepesRinger 缓冲液,用于测定细胞内钙离子浓度.1.4 心肌肌浆网钙泵活力的检测取心脏组织100mg,放人 1.5ml 的匀浆管中,制备 10%的组织匀浆;1000r/min 离心 10rain,弃沉淀,取上清液8000r/min,低温高速离心 15rain,沉淀物即为细胞肌浆网;将分离的肌浆网用冰冷的匀浆介质制备成混悬液,手工匀浆,制成的匀浆即为肌浆网匀浆液;用考马斯亮蓝法测定混悬液中的心肌肌浆网蛋白含量,牛血清白蛋白作标准;肌浆网钙泵测定原理:ATP可分解 ATP 生成 ADP 及无机磷,
13、测定无机磷的含量可判断 ATP活力的高低;操作步骤(采用比?419?色定磷法)参照试剂盒说明书进行.1.5 心肌细胞内钙离子测定酶法分离心肌细胞,制备成细胞浓度为 10/L 的细胞悬液,经台盼蓝排斥试验检查,细胞成活率达 95%以上.在细胞悬液中加入 Fura 一 2/AM 使终浓度为 5Imol/L,37oC 恒温振荡 30rain,负载后以含 0.2%牛血清白蛋白的HepesRinger 缓冲液洗细胞 2 次.采用荧光分光光度计进行荧光测定,根据公式计算细胞内游离钙浓度;ICa“Ii=Kd(R-Rmin)Fmin380/(RmaxR)Fmax380(nmol/L),其中 Kd 为 ca“与
14、 Fura.2 结合的解离常数,其值为 224nmol/L,R=F340/F380.注:R 为两激发光波长的荧光比值(F340/F380),R 为最小荧光值,即胞内 Fura 一 2 完全解离,未与 Ca“结合时两激发光波长的比值,R 为最大荧光值,即胞内 Fura 一 2 被 ca“饱和时两激发光波长的比值.1.6 统计学方法所有数据以S 表示,多个样本均数比较采用单因素方差分析,所有数据由SPSS13.0 统计软件处理,以 P0.05 为差异有统计学意义.2 结果2.1 腹主动脉缩窄型高血压大鼠模型建立高血压模型术后收缩压明显高于对照组,差异有非常显着性(P0.01,见表 1).表 l 两
15、组收缩压变化(mmHg,s)注:Sham 组为假手术组;AAC 组为主动脉缩窄型高血压组.与Sham 组比较,#0.012.2 两组左心室重量指数术后 4 周,腹主动脉缩窄型高血压组左心室重量和左心室重量指数均明显高于假手术组(均 P0.O1,见表 2).表 2 两组左室重量和左心室重量指数(s)注:Sham 组为假手术组;AAC 组为主动脉缩窄型高血压组.与Sham 组比较,#P0.05,#P0.012.3 两组心肌肌浆网钙泵活力和细胞内钙离子浓度与假手术组比较,腹主动脉缩窄型高血压组肌浆网钙泵活力明显降低(P0.01),心肌细胞内钙离子浓度显着升高(P0.O1,见表 3).?420?表 3
16、 两组心肌肌浆网钙泵活力和细胞内钙离子浓度注:Sham 组为假手术组;AAC 组为主动脉缩窄型高血压组.与Sham 组比较,槲 P0.O13 讨论本研究发现腹主动脉缩窄后 4 周,大鼠收缩压显着升高,心脏重量和左室肥厚指数的改变,都充分显示压力超负荷导致了心肌肥厚的发生,表明本实验心肌肥厚动物模型已成功建立.高血压左室肥厚时,心血管意外的发生率显着增加 J.压力超负荷引起心肌肥厚的确切机制仍不是很明确,但是心肌细胞 Ca“超载是高压力负荷致心肌舒缩功能障碍的重要病理生理机制一.肌浆网钙泵(SERCA)调节 Can 的释放,摄取与储存,心肌细胞兴奋时,细胞外 Ca“通过钙通道进入细胞内,诱发肌浆
17、网释放 ca,细胞内 ca 大于或等于10mol/L 时,Can 与心肌肌钙蛋白结合,使心肌细胞收缩.心肌细胞收缩末期,启动肌浆网上的钙泵,摄取细胞内钙储存于肌浆网内,使游离 Ca 下降,心肌舒张.心肌肥厚过程中,胞膜及肌浆网上与钙转运调控相关的基因表达发生改变是心肌舒缩性能降低的重要机制.SERCA 在心肌舒张期发挥主要作用,钙泵的活性降低,会引起肌浆网摄取钙的功能下降,导致心肌舒张功能障碍.自发性高血压大鼠左室肥厚时,心肌细胞肌浆网钙泵活力较正常组明显降低.本研究显示,腹主动脉缩窄型高血压组肌浆网钙泵活力较假手术组明显降低,心肌细胞内钙离子浓度显着升高.有实验显示,24 周高血压大鼠左心室
18、心肌肌浆网 ATP 酶活力较对照组明显降低 ,这就导致了 CaATPase 将胞浆内游离钙泵回肌浆网的能力下降,使心肌细胞内游离钙浓度升高进一皖南医学院(JofWalmanMedicalUniversity)28(6步导致左室肥厚的形成 J.在高血压病左室肥厚的过程中,SERCA 活性显着降低 ,细胞浆内游离ca 向肌浆网内泵人减少,造成胞内 cai 过度升高,心肌Cai 的增加可激活钙调神经磷酸酶,通过对一系列转录因子的活化而实现对基因转录的调节,从而使细胞表型发生改变以适应环境,最终导致心肌肥大和左心室肥厚的发生.有人认为 SERCA活性降低可能是高血压病左室肥厚发生发展的重要始动因素之一
19、 9j.合适的抗高血压治疗能够减轻或逆转高血压左室肥厚,并可明显降低心血管事件的发生,故挑选一种能够恢复心肌肌浆网钙泵活力的抗高血压药物,不失为明智之举.【参考文献】1吴杨,杨惠超 ,陈翔.辛伐他汀对大鼠心肌肥厚的防治作用及其与钙通道的关系J.中华心血管病杂志,2009,37(4):352357.2VERDECCHIAP,ANGELIF,BORGIONIC,eta1.Changesincardiovascularriskbyreductionofleftventricularmassinhyper-tension:ameta.analysisJ.AmJHypeertens,2003,16:89
20、5899.3MACKENZIEL,RODERICKHL,PROVENA,eta1.Inositol1,4,5-trisphosphatereceptorsintheheartJ.BiolRes,2004,37(5):553537.4KIMMJ,joDG,HONGGS,etu1.Calpaindependentcleavageofcain/cabinlactivatescalcineurintomediatecalcium-trig-geredcelldeathJ.Pnas,2002,99(12):98709875.5KHACHIGIANLM.Earlygrowthresponseincardi
21、ovascularpathobiologyJ.CircRes,2006,98(2):186191.6VANDENBOSCHBJ,LINDSEYPJ,VANDENBURGCM,eta1.EarlyandtransientgerlfexpressionchangesinpressureoverloadinducedcardiachypertrophyinmiceJ.Genomics,2006,88(4):480488.7陆曙,张志斌 ,龚少愚,等.异莲心碱防止高血压大鼠左室肥厚的可能机制J.中华高血压杂志,2008,16(1):3335.8李悟.心肌肌浆网钙转运蛋白结构,功能调节和基因表达J心脏杂志,2003,15(1):64 66.9CHANGJIANGGE,SHENJIANGHU,SHENWU,eta1.EffectsofatorvastatinonvascularremodelinginspontaneouslyhypertensiveratsJ.JZhejiangUniversityScience,2003,4(5):612615.
