1、可溶性人类白细胞抗原 G 表达及其临床意义46?空堡王细胞整 i 直( 电壬) 生旦第 2 期ChinCellStemCellTransplant(ElectronicEdition),Oct2009,No.2可溶性人类白细胞抗原 G 表达及其临床意义邱建新罗明 TeraaskiPIMillerJ【摘要】目的人类白细胞抗原 G(HLAG)作为一种具有免疫抑制功能的分子正日益受到关注,本研究检测了肾移植患者序列血清标本中可溶性 HLA.G(sHLAG)的表达,以阐明其在肾移植中的临床意义.方法用 ELISA 方法检测 65 例患者总计 330 份血清标本的 sHLA.G.在此之前,已进行 HLA
2、IgG/IgM 抗体和 MICA 抗体的检测.结果通过对 65 例患者的 330 份血清标本的系列分析,在.肾功能正常组的 26 例患者中,50%的患者 sHLA.G 持续表达或转为阳性,相比较而言,移植肾排斥组的 39 例患者中仅 20.5%的患者 sHLAG 持续表达或转为阳性(P=0.013).因此,sHLA.G 与移植肾功能的维持有关联.80%的 HLAIgG 阳性的血清中没有sHLAG 表达(77/96), 而 81.4%的 HLAG 阳性的血清中没有 HLA.IgG(83/102)(P=O.005),表明 sHLAG 的表达和 HLAIgG 抗体( 先前已被证明与移植肾失功相关)的
3、出现呈负相关.结论在本研究中,发现约 30%的肾移植患者血清中存在 sHLA.G;sHLA.G 与移植.肾慢性排斥失功呈负相关,也与 HLAIgG 抗体的产生呈负相关.sHLA.G 在.肾移植中的确切意义有待于进一步研究.【关键词】HLAG;HLA 抗体;肾移植;排斥SolubleHLA-GexpressionandrenalgraftacceptanceQ,UJian-xin*,LUOMing,TerasakiPI,MillerJ.*Departmentofrenaltransplantationandurology,ShanghaiFirslPeopleHospitalAffiliated
4、toJiaotongUniversity,Shanghai200080,ChinaCorrespondingauthor.“QIUJian-xin,E-【Abstract】ObjectivesHLAGisapotentiallyinterestingmoleculeassociatedwithimmunosuppressivefunction.HerewetrytodefineitSfunctionsinrenaltransplants.MethodsWesurveythepresenceofsolubleHLAG(sHLAG,inserialserumsamplesofrenalanspla
5、ntswithELISAtests.ResultsAfterserialanalysisofthe65patients330sera.50%of26patientsinfunctioninggrouphadconsistentsHLAGexpressionorbecamepositive.incomparisonto20.5%among39patientswhorejectedtheirtransplants(尸=O.013).ThussHLAGwasassociatedwithfunctioningtransplants.Eightypercent(77of96)oftheHLAIgGpos
6、itiveserahadnosHLAGexpression,while81.4%(83of102)oftheHLAG(+)serahadnoHLAIgGf.p=O.005),whichshowedanegativeassociationbetweensHLAGandthepresenceofHLAIgGantibodies(whichwaspreviouslybeenshowntobeassociatedwithfailure).ConclusionsInthispreliminarysurvey.sHLAGwasfoundintheserumofabout30%ofrenaltranspla
7、ntpatients.sHLAGhadanegativeassociationwithallografifailurefromchronicrejection,andanegativerelationshipwiththeproductionofHLAIgGantibodies.ThesignificanceofsHLAGinrenaltransplantsremainstobedetermined.【Keywords】 HLA.G:HLAantibody;Kidneytransplantation;RejectionHLAG 是一种非经典的 HLA.I 类分子,具有独特的功能.与其他 HLA
8、.I 类分子相反 ,由 15 个等位基因编码 7 种不同的蛋白质亚型:HLA.G1HLAG4是膜结合性的,而 HLA.G5HLAG7 是可溶性作者单位:200080 上海,交通大学附属第一人民医院肾移植泌尿科(邱建新,罗明); 美国 Terasaki 基金会实验室(TerasakiPI);美国Miami 大学医学院外科(Mi1lerJ)通讯作者:邱建新,E-mail:cn?临床研究?的1,.HLA.G 仅在生理条件下表达在髓质胸腺上皮细胞上和外周胚胎组织上,其特异性的免疫抑制作用可防止胚胎被母体免疫系统排斥 l3.在病理状态下,HLA G 可表达在细胞因子活化的抗原提呈细胞(APC)上,病毒感
9、染的细胞上_6_,在炎性疾病期间也可以表达 l7l.HLA.G 蛋白被发现与白血病的不良后果及免疫缺陷有关,能够提供肿瘤细胞逃避机制|8l.在心脏和肾脏肝/脏移植中,HLA G 分子在虫堡缉王壁撞 i 里 2QQ 至笠 2 曼鳇!卫卫! 堡 Q 旦!Q),QQQ 里,Q:?47-表 1 两组患者一般临床资料比较移植物活检组织和血清中都可以检测到.HLA.G 的表达和移植耐受有关,通常表现为较少发生急性排斥反应且无慢性排斥反应发生【l0,“.迄今为止,HLA.G还没有在.肾移植中被单独检测.本研究通过探索以明确 sHLA.G 是否也在肾移植中表达及 sHLA.G 与移植肾功能的关系,同时也研究
10、sHLA.G 与移植肾失功,慢性排斥反应及产生抗 HLA 抗体的关系.1 对象和方法1.1 研究对象1991 年至 1999 年,在 Miami 大学 Jackson 纪念医疗中心有 1095 例患者首次接受活体供肾移植或尸体供肾移植.在 1095 例患者中,107 例患者的移植肾于 1000d 后因慢性排斥反应失功.因本研究与慢性排斥反应导致的移植肾失功有关,因此选择 1000d 存活率作为观察存活时间.在 107 例患者中,选择因慢性排斥反应导致移植肾失功且移植术前血清中 HLA 抗体阴性的患者,避免了移植术前预存抗体产生的并发症.部分患者提供的血清量充足未能全部用于研究,最终有 39 例
11、移植肾失功的患者被纳入研究中.对照组血清来自配对的 26 例肾移植患者,他们与移植肾失功组的 39 例患者移植时问尽可能相近(最长间隔 1周),血清量足够用于研究,采用相同的免疫抑制剂和治疗方法,对照组的移植肾在 2003 年仍保持功能.两组间在尸体/活体数量,受者年龄,受者性别,HLA 错配和免疫抑制治疗方法无显着差异(表 1)12,.平均随访时间 6 年(312 年),每位患者选择56 个时间点检测血清中 sHLAG 和 HLA 抗体.共检测分析 338 份血清,其中,130 份来自移植肾功能正常组,200 份来自移植肾排斥组,另有 8 例患者的血清标本在移植术前获得.1.2LISA 检测
12、 sHLA.G1_2_1 抗体用抗一 HLA.G5/G6 单克隆抗体(mAb)5A6G7 识别 HLAG5 和 HLA.G6E1.二抗是鼠抗人 HLAABC.IgG2a-Biotin(Serotec,SanDiego,CA,USA).1_2_2 酶联免疫吸附试验(ELISA)微孔滴定板用5A6G7 包被,20ul/孔,37孵育 2h,0.2%PBS.Tween洗脱 5 次.底板用 2%PBSBSA(20L)阻断(37 ,2h).每-TLDI:I 入 15u1 血清标本(1:3 稀释),4孵育过夜.再每孔加入 15IxlW6/32Biotin 后 37孵育 1h.然后每孔加入 15IxlSrep
13、tavidinAP37孵育 1h.最后在室温下每孔加入 10IxlTMB 和 5l1NHC1 停止反应.用 ELX800 全自动定量绘图酶标仪在光密度630nlrl 处测定读取底板.M8 一 pcDNA 和 M8.HLA.G5细胞株的上清液分别作为阴性和阳性对照15.结果等于或高于阴性对照平均值的两倍认为是阳性.1.3HLA 抗体检测用 Lambda 抗原混合板(LATTMMIXED),流式 PRA 或者 LABScre 测定法按照说明检测 HLAIgG 抗体 (OneLambda,Inc,CanogaPark,CA,USA).用我们曾经报道过的相同的方法检测 HLAIgM 抗体.用重组 MI
14、CA 细胞株通过细胞毒实验检测 MCIA 抗体_l3_.1.4 统计分析采用 SPSS13.0 软件对数据统计学分析,结果用 7c+S表示.用非配对 Student-t 检验分析均数差异的统计学意义.用检验分析率的统计学意义.2 结果2.1 正常受试者和移植术前患者的 sHLAG28 例正常男性和 2 例未生育女性的 sHLA.G 均阴性.8 例患者在移植术前 1114d(平均 60d)采取血清并检测,sHLA.G 也是阴性,其中 2 例患者移植术后产生 sHLAG.2.2sHLA.G 与妊娠20 例女性患者,12 例经产妇患者中 2 例出现sHLA.G.8 例无孕史的女性患者中有 1 例 s
15、HLA.G 阳性.因此,孕史并不影响 sHLA.G 的表达(表 2).表 2 孕史和移植术后首次标本检测 sHLAG例(%)中华细胞与干细胞移植(电子版)2009 年 1O 月第 2 期ChinCellStemCellTransolant(ElectronicEdition),Oct2009,No.22.3sHLA.G 在肾功能正常组和排斥组中的表达在肾功能正常组和排斥组中,按 sHLAG 结果对患者进行首次分组.sHLA.G 阳性组包括 sHLA.G 持续阳性和转变为阳性的患者,而 sHLAG 阴性组包括sHLAG 阴性和由阳性转变为阴性的患者.在肾功能正常组中,13 例(50%)患者在 H
16、LA.G 阳性组,而排斥组中仅有 8 例(20.5%)患者在 HLA-G 阳性组=0.013,表 3).在排斥组中,56.4%(22/39)的患者持续没有 sHLAG 出现,23.1%(9/39)的患者在移植肾失功前 sHLA.G 转变为阴性.虽然有 8 例 sHLA.G 阳性的患者移植肾失功,但有一半 sHLA.G 消失的患者出现了排斥反应.表 3sHLAG 变化与移植.肾排斥例(%)2.4sHLA.G 表达和 HLA 抗体的关系移植术后,从 65 例患者获取的 330 份血清得到检测,研究 sHLA.G 和 HLA 抗体及 MICA 抗体的关系.表 4 显示 sHLA.G 与各种抗体的联系
17、.在含有 HLA.IgG 抗体的血清标本中,无 sHLA.G 表达的占 80.2%(77/96),而 81.4%(83/102)的 HLA.G 阳性血清中无HLA.IgG 抗体 (P=0.005).在含有 MICA 抗体的血清中,HLA.G 阳性的占 35.9%(23/64),无 sHLAG 的占 64.1%(41/64,P0.05).如果考虑全部抗体阳性的血清(HLA.IgG/IgM 或 MICA),HLAG 阳性的占26.1%(37/142),无 sHLA.G 的占 73.9%(105/142,P=0.04).由此可得出 sHLA.G 与 HLA 抗体呈负相关.3 讨论自从早期在母体.胎儿
18、接触部位的胚胎细胞中发现 HLA.G,研究主要集中在这种分子对保护胎儿的可能性上 ll6.HLAG 在 CD4 和 CD8T 细胞上均有表达_l.因为 HLA.G 在病理过程和病毒感染时表达在组织上_6,被认为是炎症反应中具有组织保护作用的分子 E17.测定方法的改进 ,即用单克隆抗体检测 HLA.G 的可溶性类型使得在血浆和羊水中检测sHLAG 成为可能 El8.结果显示 HLAG 的可溶性亚型是由单核细胞分泌_l.已有报道 HLA.G 通过两种机制影响移植过程 E2o.首先 ,HLAG 可以抑制 NK 细胞和 CD8T 细胞介导的细胞溶解.其次,HLA.G 可以抑制 CD4T细胞的增殖反应
19、.这两种机制都显示 HLAG 分子影响与移植物排斥有关的效应细胞 l2.特别是可溶性HLAG 能够诱导 CD8T 细胞和 NK 细胞凋亡,并且在同种异体移植术后的活体内可通过外周清除同种异体反应性 T 细胞参与移植物耐受.以往对 HLAG1 和HLA.G5 在混合性淋巴细胞反应中的作用分析显示二者均能抑制 T 细胞的增殖反应瞳,z.这种抑制能够用抗一 HLAG 单克隆抗体逆转 E26.几乎所有的机制主要影响急性排斥反应的发生,而对慢性排斥反应过程的影响还需要进一步研究.有记录发现 51 例心脏移植患者中有 9 例出现了sHLA.GE“.相比较 HLA.G 阴性的患者,HLA.G 阳性的患者急性
20、排斥反应发生率更低.HLA.G 阳性的患者没有出现慢性排斥反应.sHLAG 在 21 例肝移植患者和 29 例肝一肾联合移植患者中被发现有明显升高27l.本研究显示 65 例肾移植患者的血清中存在sHLA.G.虽然样本量小,但研究中未在肾移植术前检测到 sHLAG.孕史对 sHLA.G 的表达也没有影响.移植术后,sHLA.G 往往更多的出现在移植.肾功能正常的患者.当患者根据 sHLA.G 变化分组时,sHLA.G 阴性组中(包括 sHLA.G 持续阴性和 sHLA.G 短暂阳性的患者)因慢性排斥反应导致移植肾失功的发生率显着增高.结果表明 sHLA.G 可能与移植肾排斥呈负相关.令人惊讶的
21、是在如此多的肾移植患者血清中出现 HLAG 分子.它们的确切作用仍然需要深入研究.这种情况可能与一些不确定因素有关,例如使用类固表 4sHLA.G 与抗体的关系例(%)中华细胞与干细胞移植(电子版)2009 年 lO 月第 2 期ChinCellStemCellTransolant(ElectronicEdition).0ct2009.No.2醇导致 sHLA.G 分泌|28.本研究发现一个明确的负相关,即 sHLAG 阳性的血清中很少出现 HLA.IgG 抗体.sHLAG 可能会抑制针对 HLA 的体液免疫应答.有研究显示可溶性HLA.G 能够抑制 CD4T 细胞同种异体反应性 E263,同
22、时也抑制了 B 细胞的功能z.,.o-. 显然,推理可知,作用于 HLA 抗体形成也将影响慢性排斥反应31.总之,sHLAG 在约 30%的肾移植患者血清中出现且与慢性移植物失功呈负相关.然而,它的重要性仍不完全清楚.本研究的一个结果就是与缺乏sHLA.G 的血清相比,存在 sHLAG 的血清中 HLA 抗体也少.sHLAG 阳性的患者往往显示更好的移植肾耐受.参考文献1KirszenbaumM,DjoulahS,HorsJ,eta1.HLAGgenepolymorphismsegregationwithinCEPHreferencefamiliesJ.HumImmunol,1997,53:1
23、40-147.2IshitaniA,KishidaM,SageshimaN,eta1.Re-examinationofHLA-GpolymorphisminAfricanAmericansJ.Immunogenetics,1999,49:8088l1.3SolierC,Aguerre-GirtM,LenfantF,eta1.Secretionofproapoptoticintron4-retainingsolubleHLAG1byhumanvilloustrophoblastJ.EurJImmtmol,2002,32:35763586.4YangChuW,GeraghtyDE,eta1.Exp
24、ressionofHLA?GinhumanmononuclearphagocytesandselectiveinductionbyIFN?gammaJ.JImmunol,1996,156:42244231.5MoreauP,Adrian?CabestreF,MenierC,eta1.IL-10selectivelyinducesHLA.GexpressioninhumantrophoblastsandmonocytesJ.IntImmunol,1999,l1:803.8l1.6OnnoM,PangaultC,LeFriecG,eta1.ModulationofHLAGantigensexpre
25、ssionbyhumancytomegalovirus:SpecificinductioninactivatedmacrophagesharboringhumancytomegalovirusinfectionJ.JImmunol,2000,l64:6426.6434.7AractingiS,BriandN,LeDanffC,eta1.HLA-GandNKreceptorareexpressedinpsoriaticskin:ApossiblepathwayforregulatinginfiltratingTcells?AmJPathol,2001,159:71.77.8NuckelH,Reb
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